Intensification in the manufacturing of the therapeutic pre-miR-29b through perfusion cultures

Oligonucleotides are short nucleic acids that play a key role in gene therapy, due to the direct modulation of gene expression, which is challenging to address with standard pharmacological approaches. Indeed, among the different nucleotides-based therapeutics, the administration of pre-miR-29b, the precursor of a non-coding microRNA, has been documented to retard the formation of amyloid plaques, proteins associated to Alzheimer’s disease development. However, reliable and cost-effective large-scale manufacturing technologies for this biotherapeutic are currently not available. A promising approach lies in its recombinant production using Rhodovulum Sulfidophilum, secreting the nucleic acids in a RNase-free environment. Still, pre-miR-29b biomanufacturing from this host has been reported so far at very small scales and at low titer, not suitable to ensure this important therapeutic to the patients. This makes the development of high throughput bioprocesses extremely urgent. This work aims at developing a continuous bioprocess platform, including a perfusion upstream process followed by the reversed-phase chromatographic purification of the product. First, a bench-top batch process was operated to investigate main variables trends and analyze potential scale-up issues. Subsequently, a small-scale optimization was conducted in perfusion configuration to deeply understand the role of sodium chloride (NaCl) concentration in the medium on cell growth and pre-miR-29b productivity. The results acquired on these scale-down models were validated in three liter-scale perfusion bioreactors operated at different perfusion rates and NaCl concentration. Overall, increased productivity and lower medium consumption were reported at higher perfusion rates and NaCl concentration while cell growth was maximized at lower salt concentration. Finally, preliminary tests aimed at defining the maximum adsorption capacity for the chromatography resin used for the isolation of the product were conducted. In conclusion, this work represents an important step towards the continuous production of pre-miR-29b via recombinant technology. Future efforts will focus on the downstream purification, which requires extensive investigation to develop an optimized chromatographic purification of the target product. The ultimate goal is the integration of upstream and downstream sections into an end-to-end continuous manufacturing platform, able to further enhance productivities and product attributes.

Gli oligonucleotidi sono acidi nucleici che rivestono un ruolo chiave nella terapia genica, consentendo di trattare malattie genetiche spesso difficili da affrontare con le terapie farmacologiche tradizionali. Ad esempio, la somministrazione di pre-miR-29b, un microRNA, è stata associata al rallentamento della formazione delle placche amiloidi, un tratto patologico del morbo di Alzheimer. Tuttavia, le tecnologie di produzione di acidi nucleici attualmente disponibili non sono economicamente sostenibili. Una possibile soluzione consiste nella produzione ricombinante mediante il batterio Rhodovulum Sulfidophilum, capace di secernere gli acidi nucleici extracellularmente, impedendo al contempo il rilascio di RNasi nel mezzo di coltura. Ciò nonostante, la produzione tramite tecnologia ricombinante di pre-miR-29b è stata finora riportata solo su volumi ridotti e con una resa insufficiente per una produzione su scala commerciale. Questa tesi ha l’obiettivo di sviluppare una piattaforma di produzione in continuo, nella quale un processo a perfusione è seguito da una purificazione tramite cromatografia a fase inversa. Inizialmente, è stato utilizzato un reattore batch per studiare eventuali problematiche legate allo scale-up. Successivamente, è stata realizzata un’ottimizzazione su modelli a piccola scala per misurare l’impatto della concentrazione di cloruro di sodio (NaCl) nel mezzo di coltura sulla crescita cellulare e sulla produzione di pre-miR-29b. In una fase successiva, tre bioreattori a perfusione sono stati operati a diversi tassi di perfusione e concentrazioni di NaCl nel mezzo di coltura. Nel complesso, l’aumento del tasso di perfusione e della concentrazione di sale hanno portato a una maggiore produttività e a un minore consumo di nutrienti, mentre la crescita cellulare è stata rallentata in condizioni di eccessiva osmolarità. Infine, è stato condotto un esperimento di breakthrough per misurare la capacità di adsorbimento massima della colonna cromatografica. Questo studio rappresenta un passo importante verso la produzione in continuo di oligonucleotidi tramite tecnologia ricombinante. In futuro, maggiore attenzione potrà essere posta sulla fase di purificazione, con l’obiettivo finale di incrementare la produttività complessiva e la qualità del prodotto integrando le sezioni di upstream e downstream, sviluppando una piattaforma di biomanufacturing continua “end-to-end”.