Microfluidics-assisted synthesis and characterization of drug loaded PLGA-based nanoparticles for the treatment of metastatic melanoma

Despite recent advances and the introduction of immunotherapy, current treatments for metastatic melanoma remain limited in efficacy due to drug resistance and severe side effects. Nanomedicine can improve cancer therapy: polymeric nanoparticles (NPs) offer a more efficient drug delivery to tumors while reducing side effects. In this context, poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), a biodegradable polymer, is widely used for its biocompatibility and possibility of surface modifications. Previous works of the SBN Lab developed a nanoprecipitation protocol to synthesize trametinib (an FDA approved inhibitor of MEK1, 2 for BRAF V600-mutated melanoma)- loaded PLGA NPs coated with polyvinyl alcohol (PVA), referred as PLGA@PVA NPs. These NPs showed superior therapeutic efficacy with respect to the free drug in patient-derived cell lines and melanoma xenograft murine models. In this thesis, the synthesis of PLGA@PVA NPs was scaled up using a microfluidics system. NPs were tested in immunocompetent syngeneic murine melanoma models, but with poor biodistribution: only about 5% of NPs reached the tumor, probably due to protein replacement of the physically adsorbed PVA coating. To enhance NPs’ stealth properties, the stabilization strategy was modified by covalently linking the hydrophilic polymer to the PLGA backbone. Thus, a mixture of PLGA-COOH and PEG-PLGA polymers was used to obtain PLGA NPs with 25% and 50% of PEG-PLGA. NPs production was firstly performed with an optimized benchtop nanoprecipitation procedure and then successfully scaled-up with a microfluidics-assisted synthesis; in addition, microfluidics significantly improved the encapsulation efficiency of drug-loaded NPs. NPs’ size and size polydispersity were characterized with Dynamic Light Scattering (DLS) analysis. Colloidal stability and protein corona (PC) formation in biological media were assessed to select the most suitable NPs for in vivo applications. NPs were firstly incubated (37°C, relative humidity = 95%) in cell culture media (RPMI and IMDM +10% FBS) and analyzed with DLS at specific timepoints, showing a good colloidal stability. PC composition was evaluated qualitatively with SDS-PAGE electrophoresis, revealing that 50% PEG-PLGA NPs formed a reduced PC with respect to PLGA@PVA NPs. The same study was performed in murine plasma, confirming that 50% PEG-PLGA NPs were more colloidal stable and formed a reduced PC compared to PLGA@PVA NPs. Viability assays confirmed that NPs were not harmful to the cells, while drug-loaded NPs significantly reduced the IC50 value with respect to free drug administration. As a future perspective, 50% PEG-PLGA NPs will be tested in vivo in syngeneic murine models to evaluate their biodistribution.

Nonostante i recenti miglioramenti e l’introduzione dell’immunoterapia, le terapie attuali per il melanoma metastatico mostrano ancora un’efficacia limitata a causa della resistenza ai farmaci e dell’insorgenza di gravi effetti collaterali. La nanomedicina può migliorare la terapia del cancro: le nanoparticelle polimeriche (NPs) offrono un miglior trasporto del farmaco ai tumori riducendo gli effetti collaterali. In questo ambito, l’acido poli(lattico-co- glicolico) (PLGA), un polimero biodegradabile, è largamente impiegato grazie alla sua biocompatibilità e la possibilità di modifiche superficiali. Durante i precedenti studi condotti dall’SBN Lab è stato sviluppato un protocollo di nanoprecipitazione per la sintesi di PLGA NPs caricate con trametinib (un inibitore, approvato dall’FDA, di MEK1, 2 del melanoma con mutazione BRAF V600) e rivestite con alcol polivinilico (PVA), denominate PLGA@PVA NPs. Queste NPs hanno mostrato un’efficacia terapeutica migliore rispetto al farmaco libero in linee cellulari derivate da pazienti e in modelli murini con xeno-trapianto di melanoma. In questa tesi, la sintesi delle PLGA@PVA NPs è stata ampliata su larga scala tramite un sistema di microfluidica. Le NPs sono state testate su modelli murini immunocompetenti singenici di melanoma, ma ottenendo una scarsa biodistribuzione: solo il 5% delle NPs ha raggiunto il tumore, probabilmente a causa della sostituzione del rivestimento fisicamente assorbito di PVA da parte delle proteine. Per aumentare le proprietà di occultamento ("stealth effect") delle NPs, la strategia di stabilizzazione è stata modificata, legando covalentemente il polimero idrofilico alla catena di PLGA. Pertanto, una miscela dei polimeri PLGA-COOH e PEGPLGA è stata usata per ottenere PLGA NPs con il 25% e il 50% di PEG-PLGA. La produzione di NPs è stata inizialmente eseguita con una procedura di nanoprecipitazione ottimizzata e in seguito è stata ampliata su larga scala utilizzando la microfluidica; inoltre, la microfluidica ha notevolmente migliorato l’efficienza di incapsulamento delle NPs caricate con farmaco. Dimensione e relativa polidispersità delle NPs sono state caratterizzate con l’analisi di Dynamic Light Scattering (DLS). La stabilità colloidale e la formazione della corona proteica (PC) nei mezzi biologici sono state valutate in modo da selezionare le NPs più adatte per applicazioni in vivo. Le NPs sono state inizialmente incubate (37°C, umidità relativa = 95%) in mezzi di coltura cellulare (RPMI e IMDM +10% FBS) e analizzate con DLS in momenti specifici, mostrando una buona stabilità colloidale. La composizione della PC è stata valutata qualitativamente con elettroforesi SDS-PAGE, mostrando che le 50% PEG-PLGA NPs formano una PC minore rispetto alle PLGA@PVA NPs. Lo stesso test è stato eseguito in plasma murino, confermando che le 50% PEG-PLGA sono più colloidalmente stabili e formano una PC minore rispetto alle PLGA@PVA NPs. Tramite i test di vitalità le NPs non sono risultate dannose per le cellule, mentre le NPs caricate con il farmaco hanno permesso di ridurre drasticamente il valore di IC50 rispetto alla somministrazione del farmaco libero. Come prospettiva futura, le 50% PEG-PLGA NPs saranno testate in vivo su modelli murini singenici per valutarne la biodistribuzione.