Caratterizzazione di rivestimenti porosi in titanio per l'ancoraggio osseo

1. Introduction Titanium and its alloys are widely used in orthopaedics because they are highly biocompatible materials with good fatigue strength and corrosion resistance. Still, titanium lacks the ability to form a strong interface with surrounding tissue and its relative high stiffness can lead to stress shielding of surrounding bone and subsequent implant loosening. As such, surface modification is usually performed to improve bone ingrowth and implants osseointegration. They are sand-blasting methods, chemical and biochemical methods, calcium phosphates coating and metallic coating. Porous metallic scaffold have recently gained recognition as a promising avenue toward the regeneration of damaged bone structures. Interest in these materials resides in their ability to guide bone growth by presenting a favorable structure for cellular adhesion and three dimensional proliferation. 2. Materials and methods In this work we analyzed the properties of a novel titanium foam, produced by a powder metallurgy process, patented by Louis Philippe Lefebvre, at National Research Council Canada, Industrial Materials Institute. In order to assess adhesion properties of this coating, tension tests where performed in conformity with ASTM F 1147-05. We did technical drawings to prepare the samples according to the guidance [Fig. 1]. We used twenty four cylindrical samples: • twelve, with porous coatings of three different lottery of production, with a porosity of 68, 65 e 48% [Tab.1]; • twelve, with a sandblasted surface; we refer to them with the term analogous. Tab. 1: marks and dimensions of the samples with the porous coating; in the table we report also the porosity of the coating. LOTTERY SAMPLE POROSITY D A mark [%] [mm] [mm2] 8.5 8.5-1 68 19 283,39 8.5-2 19 283,39 8.5-3 19 283,39 8.5-5 19 283,39 9.5 9.5-1 65 19 283,39 9.5-2 19 283,39 9.5-4 19 283,39 9.5-5 19 283,39 11.5 11.5-2 48 19 283,39 11.5-3 19 283,39 11.5-4 19 283,39 11.5-5 19 283,39 We have also studied the morphology of five commercial foams: OrchidTM, foam produced by Orchid Orthopedic Solutions (Holt, MI, USA) by Chemical Vapor Deposition; Trabecular MetalTM, (Zimmer, Warsaw, IN), tantalum foam produced by Chemical Vapor Deposition onto a polyurethane scaffold; TritaniumTM, (Stryker, Mahwah, NJ), titanium foam produced by Low Temperature Arc Vapor Deposition onto a polyurethane scaffold; titanium foam produced by Plasma Spray (Biomet, Warsaw, IN); Trabecular TitaniumTM, (Delta TT, Lima-Lto, Villanova San Daniele del Friuli, Italia), titanium foam produces by Electron Beam Melting. 2.2 Morphological characterization Using the stereomicroscopy WILD heerbrugg plan IX (with magnification of 6x, 25x and 50x) and the scanning electron microscopy (SEM) EP Zeiss Evo 50 (with magnification from 25x to 3000x), we observed samples morphology.   2.3 Mechanical characterization In order to assess mechanical properties of the titanium foam, we performed tension test accordingly to ASTM F 1147-05, reported in “The Guidance for Industry on the Testing of Metallic Plasma Sprayed Coatings on Orthopedic Implants to Support Reconsideration of Postmarket Surveillance Requirements”, where there is also a reference for the minimal value of adhesion of a coating required by the FDA. This value is 22 MPa. For the execution of the test, samples with the porous coating had to be stuck to analogous; We used one of the glue advised by the rule: the 3M Scotch-WeldTM 2214 Regular Epoxy Adhesive. We performed the tests with three procedures: A. bonding with 100 mg of glue applied to the analogous; B. bonding with 150 mg of glue applied to the analogous; C. bonding with 100 mg of glue applied to the porous coating. We tested three samples with procedure A, (8.5-3, 9.5-4 e 11.5-3), and with procedure C, (8.5-1, 11.5-4 e 11.5-5), whereas six with procedure B (8.5-2, 8.5-5, 9.5-1, 9.5-2, 9.5-5 e 11.5-2). From force values, (F), registered by the testing machine, we calculated maximum stresses (σMAX) by σMAX=F/A, where A is sample area [Tab.1]. 2.4 Biocompatibility evaluation We used MG63 cells for the evaluation of indirect cytotoxicity and cytocompatibility of the foam. For indirect cytotoxicity test, we used eighteen samples with a diameter of 6 mm and with a porosity of 48, 66 and 71%, previously autoclaved. For each porosity, we analyzed six samples: three with a culture time of two days and three with a culture time of seven days. We seeded in each well contained medium of culture, previously in contact with the samples, and controls, 10000 cells. MTT test were performed at the end of the incubation time. In the cytocompatibility test, we seeded on ten samples, sterilized by γ rays, of diameter 12 mm, 20000 cells. We analyzed five samples for an incubation time of 24 hours, and five for 72 hours; later on we examined cell adhesion and proliferation with MTT test and with SEM observations. 3. Results 3.2 3.1 Morphological characterization Commercial foams have a very different morphology: the structures derive from the process of production. The foam that we want to analyze is a network of particles of different dimensions; her structure is similar of that of a foam obtained by a sintering process. 3.2 Mechanical characterization We compared the results related to the three different procedures [Tab. 2]. Tab. 2: σMAX of the samples, for the three procedures. sample σ max MPa procedure A 8.5-3 16,51 9.5-4 19,58 11.5-3 21,63 procedure B 8.5-2 31,22 8.5-5 31,75 9.5-1 22,11 9.5-2 39,06 9.5-5 34,99 11.5-2 29,60 procedure C 8.5-1 4,39 11.5-4 1,51 11.5-5 1,51 We noticed that values of procedure C were the lowest: for example, sample 11.5-4 tested with procedure C have shown an adhesion resistance of only 1,51 MPa, whereas sample 11.5-3, having the same porosity, and tested with procedure A, have had a resistance of 21,63. We also evaluated the failure modes of the coatings by stereomicroscopy. For samples tested with procedure C, the bonding wasn’t optimum, causing the early breaking of the system coating-substratum. Consequently, we considered only the samples tested with the procedures A or B. Values of stress were bigger for the procedure B and only these results were superior of threshold of FDA [Fig. 2] Fig. 2: comparison between σMAX obtained with procedure A and procedure B. The larger quantitative of glue applied in the procedure B might have influenced on the mechanical properties of the foam: the glue might have entered into foams porosity and so have increased the samples resistance. We have also analyzed samples tested failure modes: failure was mainly mixed. We noticed in the zones of adhesive failure, the results of machining of the substrate. So material preparation before deposition of the coating wasn’t optimum: we suggested a sandblast process in order to increase substrate roughness and obtain a better adhesion of the coating to the substrate. 3.3 Biocompatibility evaluation Indirect cytotoxicity results were low, whereas cytocompatibility test have shown a good biocompatility of the foam. In fact, samples and controls absorbance were similar [Fig. 3]. Fig. 3: absorbance values of samples and control for the two incubation times: 24 and 72 hours. We concluded that foam present a favorable structure for cellular adhesion and three-dimensional proliferation. 4. Conclusion This foam is an appropriate substrate for production of bone tissue. Because of his three-dimensional environment, it can be used in bone engineering applications for hard tissue reconstruction. In order to have a better coating adhesion properties, we suggest to sandblast the substrate before coating deposition.

1. Introduzione Il titanio e le sue leghe trovano largo impiego come materiali per impianti ortopedici non cementati grazie alle loro eccellenti caratteristiche: buona biocompatibilità, elevate proprietà meccaniche e buona resistenza alla corrosione. Tuttavia, vi sono delle problematiche relative all’utilizzo di tali materiali in forma massiva: in particolare, la differenza fra la rigidezza del materiale e quella dell’osso ed il fissaggio biologico non ottimale degli impianti al tessuto osseo. Nel corso degli anni si sono pertanto utilizzati opportuni trattamenti superficiali volti al superamento di tali problematiche: rivestimenti con idrossiapatite e biovetri, modifiche chimiche e biochimiche, irruvidimento mediante sabbiatura e coating metallici porosi. Sempre più interesse suscitano attualmente i rivestimenti porosi, che permettono di ottenere un fissaggio dell’impianto stabile e di lungo termine, attraverso una completa ricrescita ossea al loro interno, e che presentano caratteristiche meccaniche compatibili con quelle del tessuto osseo ospite, anch’esso un materiale poroso. 2. Materiali e metodi In questo lavoro di tesi si sono analizzate le proprietà di schiume di titanio prodotte, secondo un processo di metallurgia delle polveri brevettato da Louis Philippe Lefebvre, presso l’Istituto Industriale dei Materiali del Centro di Ricerca Nazionale canadese, (NRC’s Industrial Materials Institute, IMI). Si è effettuata una caratterizzazione delle proprietà meccaniche, biologiche e morfologiche del materiale in esame. Per valutare l’adesione del coating al substrato, si sono eseguite delle prove di trazione secondo la normativa ASTM F 1147-05. Seguendo tale direttiva, sono stati opportunamente preparati i campioni da testare [Fig. 1].   Si sono utilizzati ventiquattro provini cilindrici in titanio massivo, di cui: • dodici, aventi il coating poroso da testare; tali rivestimenti appartengono a tre diversi lotti di produzione, aventi porosità media pari a 68, 65 e 48% [Tab.1]; • dodici, aventi superficie sabbiata, indicati nella trattazione successiva con il termine analoghi. Tab.1:sigle identificative e dimensioni dei campioni aventi il rivestimento poroso; in tabella viene indicata anche la porosità del coating. LOTTO CAMPIONE POROSITA' D A sigla [%] [mm] [mm2] 8.5 8.5-1 68 19 283,39 8.5-2 19 283,39 8.5-3 19 283,39 8.5-5 19 283,39 9.5 9.5-1 65 19 283,39 9.5-2 19 283,39 9.5-4 19 283,39 9.5-5 19 283,39 11.5 11.5-2 48 19 283,39 11.5-3 19 283,39 11.5-4 19 283,39 11.5-5 19 283,39 Si è inoltre studiata la morfologia superficiale di cinque schiume presenti in commercio: OrchidTM, schiuma prodotta dalla Orchid Orthopedic Solutions (Holt, MI, USA) attraverso Chemical Vapor Deposition; Trabecular MetalTM, (Zimmer, Warsaw, IN), schiuma di tantalio ottenuta attraverso Chemical Vapor Deposition su un precursore poliuretanico; TritaniumTM, prodotto dalla Stryker, (Mahwah, NJ), schiuma di titanio ottenuta attraverso Low Temperature Arc Vapor Deposition su un precursore poliuretanico; schiuma di titanio ottenuta attraverso tecnica Plasma Spray (Biomet, Warsaw, IN); Trabecular TitaniumTM, (Delta TT, Lima-Lto, Villanova San Daniele del Friuli, Italia), schiuma di titanio ottenuta attraverso Electron Beam Melting. 2.2 Caratterizzazione morfologica Per analizzare la morfologia dei materiali in esame, si sono utilizzati lo stereomicroscopio WILD heerbrugg plan IX (con ingrandimenti pari a 6x, 25x e 50x) e il microscopio elettronico a scansione (SEM) EP Zeiss Evo 50 a 20 kV (con ingrandimenti da 25x a 3000x). 2.3 Caratterizzazione meccanica La valutazione della resistenza adesiva dei coating, ha previsto l’esecuzione di test a trazione, secondo la normativa ASTM F 1147-05, indicata nella Guidance for Industry on the Testing of Metallic Plasma Sprayed Coatings on Orthopedic Implants to Support Reconsideration of Postmarket Surveillance Requirements, dove si fa inoltre riferimento al valore stabilito dalla FDA per l’adesione minima dei coating, pari a 22 MPa. Per l’esecuzione dei test sono stati prodotti degli afferraggi sulla base di disegni tecnici preparati conformemente alla normativa seguita, e si è utilizzata la macchina di prova INSTRON 8062. La normativa prevede che i test vengano condotti utilizzando due provini assemblati mediante un’opportuna sostanza adesiva, uno avente il rivestimento poroso da testare, e l’altro, avente superficie sabbiata, in modo tale da garantire l’incollaggio. La colla indicata dalla norma è la 3M Scotch-WeldTM 2214 Regular Epoxy Adhesive, una colla epossidica avente al suo interno particelle di alluminio. Le modalità con cui si sono condotti i test sono tre: A. incollaggio con 100 mg di colla sugli analoghi; B. incollaggio con 150 mg di colla sugli analoghi; C. incollaggio con 100 mg di colla sui coating porosi. Attraverso la modalità A si sono testate le caratteristiche di 3 campioni (8.5-3, 9.5-4 e 11.5-3), così come mediante la modalità C di prova (campioni 8.5-1, 11.5-4 e 11.5-5), mentre con la modalità B si sono testati 6 campioni (8.5-2, 8.5-5, 9.5-1, 9.5-2, 9.5-5 e 11.5-2). Dai valori di forza massima registrati, si sono infine ricavati i valori di sforzo massimo attraverso la relazione σ=F/A, secondo norma, dove A è l’area del campione rivestita della schiuma in analisi, pari a 283,39 mm2. 2.4 Caratterizzazione biologica Si sono effettuati test in vitro di citotossicità indiretta e di citocompatibilità utilizzando cellule MG63, (cellule umane di linea osteoblast like), in un medium di coltura costituito da DMEM 5671 (Sigma), FBS (10%), glutammina (1%) e penicillina/streptomicina (1%). Per i test di citotossicità indiretta, si sono utilizzati 18 dischetti di diametro 6 mm e spessore 3 mm, precedentemente sterilizzati in autoclave, aventi differente grado di porosità: 48, 66 e 71%. Per ogni porosità considerata si sono analizzati sei campioni, di cui tre per un tempo di incubazione pari a due giorni, e tre per un tempo di incubazione pari a sette giorni. In ciascun pozzetto contenente i terreni, precedentemente a contatto con le cellule, e i controlli, si sono seminate 10000 cellule. Dopo un giorno di incubazione, i terreni ed i controlli sono stati sottoposti a test MTT. Nel test di citocompatibilità si sono analizzati 10 dischetti, aventi diametro pari a 12 mm e spessore 1 mm, e porosità del 71%, precedentemente sterilizzati con raggi γ. Su ciascun campione si sono seminate 20000 cellule, con le seguenti modalità: • per cinque campioni, il tempo di coltura è stato di 24 ore; successivamente, tre sono stati sottoposti ad un test di vitalità cellulare (MTT test) e due ad analisi SEM; • per i restanti cinque, il tempo di coltura è stato di 72 ore; anche in questo caso, tre campioni sono stati in seguito sottoposti ad analisi MTT e due ad analisi SEM. 3. Risultati 3.1 Caratterizzazione morfologica Le schiume commerciali analizzate hanno differente morfologia: essa risulta fortemente influenzata dal processo di produzione. La struttura della schiuma in esame è risultata essere un network composto da particelle di differente dimensione. Tale morfologia ha ricordato la struttura di una schiuma ottenuta per semplice sinterizzazione. 3.2 Caratterizzazione meccanica Per verificare se i parametri di prova abbiano avuto o meno un’influenza sull’andamento dei test effettuati, si sono analizzati separatamente i provini testati con le diverse modalità di prova (A, B, C). In tabella 2 sono riportati i valori di sforzo massimo dei dodici campioni testati, calcolati a partire dai valori di forza massima registrati dalla macchina di prova utilizzata. I risultati a cui si è giunti attraverso la modalità C di prova risultano inferiori rispetto a quelli ottenuti attraverso le altre due modalità. Tab.2: valori di sforzo massimo calcolati a partire dai valori di Fmax risultati dai test a trazione, per le tre modalità di prova. campione σ max MPa modalità A 8.5-3 16,51 9.5-4 19,58 11.5-3 21,63 modalità B 8.5-2 31,22 8.5-5 31,75 9.5-1 22,11 9.5-2 39,06 9.5-5 34,99 11.5-2 29,60 modalità C 8.5-1 4,39 11.5-4 1,51 11.5-5 1,51 L’analisi attraverso stereomicroscopio rivela che l’incollaggio tra le superfici testate mediante la modalità C non è stato ottimale, facendo ipotizzare quindi un fallimento precoce del sistema coating-substrato. Si sono pertanto esclusi tali risultati nella trattazione successiva. In figura 2 vengono confrontati i valori di sforzo massimo ottenuti attraverso le modalità A e B: si evidenzia come i valori relativi alla modalità B siano superiori a quelli relativi alla modalità A, e che solamente i primi superino la soglia indicata dalla FDA come minima per l’adesione dei coating. Fig. 2: confronto tra i valori di sforzo massimo ottenuti attraverso le due diverse modalità di prova. In figura viene indicata anche la soglia FDA pari a 22 MPa. Il maggiore quantitativo di colla utilizzata può aver influito sui risultati trovati: la colla, penetrando all’interno delle porosità, può aver infatti aumentato le caratteristiche meccaniche dei coating testati. Inoltre, si sono analizzate le modalità di fallimento dei coating, che sono risultate essere prevalentemente di tipo misto, ossia con zone di fallimento adesivo e zone di fallimento coesivo. Tale analisi ha permesso di evidenziare come i trattamenti superficiali a cui sono stati sottoposti i substrati precedentemente alla fase di deposizione dei coating, non siano stati ottimali: nelle zone di fallimento adesivo si sono difatti notate ancora le linee di lavorazione effettuata sui substrati. Pertanto, si è ipotizzato che l’adesione coating-substrato non fosse quella massima ottenibile. Nelle applicazioni future, si potrebbe migliorare la preparazione dei substrati procedendo con un processo di sabbiatura per favorire i meccanismi di ancoraggio dei coating ai substrati. 3.3 Caratterizzazione biologica I risultati derivanti dai test di citotossicità indiretta sono relativamente bassi, a causa probabilmente della pulizia non ottimale a seguito del processo di taglio delle schiume. All’interno delle porosità possono essere rimasti dei residui di lavorazione che hanno determinato i risultati a cui si è giunti. Nonostante tali risultati, i test di citocompatibilità hanno mostrato adesione ai substrati e proliferazione cellulare tra i due istanti di tempo considerati, pari a 24 e 72 ore di coltura. I valori di assorbanza derivanti dai test MTT sono risultati paragonabili tra campioni e controllo [Fig. 3]. Fig. 3: valori di assorbanza risultati dall’analisi MTT dopo 24 e 72 ore di coltura, relativi al controllo e all’insieme pozzetto + campioni. La struttura tridimensionale delle schiume metalliche può aver promosso l’adesione e la proliferazione cellulare: tali materiali potrebbero dunque trovare applicazione come scaffold per la rigenerazione dei tessuti duri, grazie alla loro abilità di guidare la ricrescita ossea. 4. Conclusioni Le schiume analizzate in questo lavoro di tesi potrebbero essere utilizzate in applicazioni che richiedono un fissaggio di tipo biologico al tessuto osseo circostante. Devono tuttavia essere deposte su substrati che presentano caratteristiche superficiali adatte ad un processo di deposizione. Potrebbero quindi essere deposte su superfici sottoposte ad un trattamento di sabbiatura, che aumenti la rugosità del substrato e favorisca quei meccanismi di mechanical interlocking alla base dell’adesione coating-substrato.