High-throughput patterning of labile proteins for fabricating cardiac micropatterned co-cultures

One of the key challenges in cardiac tissue engineering is the ability to generate mature, functional cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells (iPSCs), a critical step for advancing applications in disease modeling, drug screen ing, and regenerative medicine. This thesis focuses on the fabrication of a patterned PDMS stamp and the development of an efficient, high-throughput micropattern ing protocol to enhance iPSC-derived ventricular cardiomyocyte (iPSC-vCM) mat uration through controlled co-culture with ventricular cardiac fibroblasts (vCFs). Using a novel PDMS stamping method, fibronectin (FN) and bovine serum albu min (BSA) were successfully micropatterned onto multiwell plates, facilitating the selective attachment and spatial organization of iPSC-vCMs and vCFs. Micropatterned co-cultures demonstrated significant improvements in cardiomy ocyte maturation compared to random co-cultures. Structural enhancements in cluded increased α-actinin expression, longer sarcomere lengths, and reduced cell circularity, all indicative of advanced structural organization, bridging the gap with adult ventricular cardiomyocytes. However, challenges in achieving consistent se lective attachment highlight the need for further optimization of cell-handling pro tocols. These findings establish a robust platform for engineering biomimetic cardiac tis sues, providing a scalable approach for studying cardiac maturation and function in vitro. Future work should focus on optimizing cell-handling methods and integrat ing additional maturation stimuli, such as mechanical or electrical conditioning, to further enhance iPSC-vCM functionality.

Una delle principali sfide nell’ingegneria tissutale cardiaca è la capacità di generare cardiomiociti maturi e funzionali a partire da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), un passaggio cruciale per il progresso delle applicazioni nella modellizzazione delle malattie, nello screening farmacologico e nella medicina rigenerativa. Questa tesi si concentra sulla fabbricazione di uno stampo in PDMS micropatternato e sullo sviluppo di un protocollo efficiente e ad elevato throughput per il micropatterning, con l’obiettivo di migliorare la maturazione dei cardiomiociti ventricolari derivati da iPSC (iPSC-vCM) attraverso la co-coltura controllata con fibroblasti cardiaci ventricolari (vCF). Utilizzando un innovativo metodo di trasferimento del micropattern dal PDMS ai multiwell, la fibronectina (FN) e l’albumina sierica bovina (BSA) sono state micropatternate con successo su piastre multiwell, facilitando l’adesione selettiva e l’organizzazione spaziale degli iPSC-vCM e dei vCF. Le co-colture micropatternate hanno dimostrato miglioramenti significativi nella maturazione dei cardiomiociti rispetto alle co-colture randomiche. I miglioramenti strutturali includono un aumento dell’espressione di α actinina, una maggiore lunghezza dei sarcomeri e una riduzione della circolarità cellulare, tutti indicatori di un’organizzazione strutturale avanzata, che riduce il divario con i cardiomiociti ventricolari adulti sotto il punto di vista della maturazione. Tuttavia, le difficoltà nel garantire un’adesione selettiva riproducibile evidenziano la necessità di ottimizzare ulteriormente i protocolli di manipolazione cellulare. Questi risultati stabiliscono una piattaforma solida per l’ingegneria di tessuti cardiaci biomimetici, offrendo un approccio scalabile per studiare la maturazione e la funzione cardiaca in vitro. I prossimi step dovrebbero concentrarsi sull’ottimizzazione dei metodi di manipolazione cellulare e sull’integrazione di ulteriori stimoli di maturazione, come la stimolazione meccanica o elettrica, per migliorare ulteriormente la funzionalità degli iPSC-vCM