Characterization of polymer bioconjugates for intracellular delivery of proteins

Protein-based therapeutics have emerged over the past decades as powerful tools offering targeted treatments, diagnosis and even prevention of several human pathologies such as cancer, diabetes, autoimmune disorders, and infectious diseases. While, the majority of protein-based therapeutics currently available target extracellular components, intracellular proteins (accounting for over 70% of genome-encoded proteins) remain largely inaccessible and are considered "undruggable" targets, limiting their therapeutic potential. Efficient intracellular delivery strategies are therefore crucial to fully exploit protein therapeutics, leading to highly effective treatments. Among various delivery approaches, protein conjugation with synthetic cationic polymers has gained attention due to its ability to enhance cellular uptake, improve bioavailability, and facilitate cytosolic release while maintaining protein activity. This master thesis work aims at obtaining a comprehensive characterization of protein-polymer conjugates for intracellular delivery through a grafting-to approach. Poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] (PDMAEMA) homopolymers were synthesized via Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP) and functionalized with fluorescent monomers to enable intracellular tracking. Superoxide Dismutase (SOD), a therapeutic enzyme targeting oxidative stress in cells, was conjugated to PDMAEMA via Copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The resulting bioconjugates were thoroughly characterized using electrophoresis, BCA assays, absorbance-based quantification methods and cytotoxicity assays to assess their biocompatibility and potential effects on cell viability. Fluorescence microscopy confirmed successful cellular internalization of the bioconjugates in vitro, demonstrating their potential for intracellular protein delivery. These results suggest that PDMAEMA-based bioconjugates hold promise as nanocarriers for therapeutic applications, with further optimization required to improve delivery efficiency and facilitate cytosolic release.

Le terapie a base di proteine si sono affermate negli ultimi decenni come strumenti innovativi per il trattamento mirato, la diagnosi e la prevenzione di numerose patologie, tra cui cancro, diabete e infezioni. Sebbene la maggior parte delle proteine terapeutiche attualmente disponibili sia rivolta a componenti extracellulari, le proteine intracellulari (che costituiscono oltre il 70% delle proteine codificate dal genoma) rimangono in gran parte inaccessibili dai farmaci convenzionali. Efficaci strategie di veicolazione intracellulare sono quindi essenziali per sfruttare a pieno il potenziale di queste terapie. Tra le tecniche di trasporto intracellulare, il legame covalente di proteine con polimeri cationici sintetici ha suscitato interesse per la loro capacità di migliorare l’internalizzazione e facilitare il rilascio citosolico, preservando al contempo l’attività della proteina. Questo progetto si concentra sulla caratterizzazione di coniugati proteina-polimero per il rilascio intracellulare, attraverso un approccio "grafting-to". Omopolimeri di poli[2-(dimetilammino)etil metacrilato] (PDMAEMA) sono stati sintetizzati con polimerizzazione radicalica per trasferimento atomico (ATRP) e poi funzionalizzati con monomeri fluorescenti per consentire il tracciamento intracellulare. L’enzima terapeutico Superossido Dismutasi (SOD), coinvolto nella protezione contro lo stress ossidativo cellulare, è stato coniugato a catene di PDMAEMA tramite cicloaddizione azide-alchino catalizzata da rame(I) (CuAAC). I bioconiugati sono stati poi caratterizzati mediante elettroforesi, saggi BCA, metodi di quantificazione basati sull’assorbanza e test di citotossicità per valutarne la biocompatibilità e i potenziali effetti sulla vitalità cellulare. L’efficace internalizzazione dei bioconiugati in vitro è stata confermata dalla microscopia a fluorescenza, dimostrando il loro potenziale per la veicolazione intracellulare di proteine terapeutiche. I risultati ottenuti suggeriscono che i coniugati a base di PDMAEMA possano rappresentare promettenti nanovettori, sebbene siano necessarie ulteriori ottimizzazioni per migliorare l'efficienza di trasporto e favorire il rilascio citosolico.