Ottimizzazione degli enzimi FPOX per l'uso diagnostico nella quantificazione dell'emoglobina glicata

Fructosyl Peptide Oxidase (FPOXs) are a family of enzymes able to cut low molecular weight Amadori products and potentially they can be used in the diagnostic field for the determination of glycated haemoglobin, an essential parameter for the monitoring of diseases like the diabetes; actually, it is detected through long and expensive techniques. However, their use is not widespread due to their very narrow access tunnel to the catalytic site, thus impeding the binding of complex substrates like glycated haemoglobin. In order to overcome this problem, the aim of the present thesis is to widen the FPOXs structure, using RosettaRemodel software for the enzymes redesign, NAMD and VMD for the evaluation of their structural stability through RMSD and RMSF analysis at the temperatures of 300K, 350K and 400K. Considering the previous thesis work, A14 mutant has been selected as the starting point, in particular a helices that is not involved in the catalytic site has been chosen to be modified. Two different types of cut have been adopted and for each of them fifteen mutants have been selected for structural stability analysis. In detail, a conservative cut of eight residues and an extended cut of forty residues have been applied. The mutants of the extended cut have shown a good structural stability for all the temperatures compared to A14, leading to the identification of two promising candidates to be submitted to experimental tests. Together with them, also the two best mutants obtain from conservative cut at 300K, the only temperature where the enzymes have maintained a better stability compared to A14, have been selected. The four mutants will be tested at the Latvian Institute of Organic Synthesis (LIOS) based in Riga.

L’ossidasi del fruttosil-peptide (FPOX) è una famiglia di enzimi in grado di tagliare prodotti di Amadori a basso peso molecolare ed è potenzialmente utilizzabile nel campo della diagnostica per la determinazione dell’emoglobina glicata, parametro essenziale nel monitoraggio di patologie come il diabete, attualmente rilevata tramite tecniche lunghe e costose. Tuttavia, il loro impiego è ancora limitato a causa di un tunnel di accesso al sito catalitico troppo stretto per legare substrati complessi come l’emoglobina glicata. Per ovviare a questa problematica, l’obiettivo del presente elaborato verte sull’ampliamento strutturale delle FPOX, in particolare utilizzando i software RosettaRemodel per il redesign degli enzimi, NAMD e VMD per valutarne la stabilità strutturale tramite l’analisi RMSD e RMSF alle temperature di 300K, 350K e 400K. Il mutante A14 è stato selezionato come enzima di partenza, modificandolo in corrispondenza di un’elica che non viene coinvolta nell’attività catalitica. Sono state adottate due tipologie di taglio, per ciascuna delle quali sono stati selezionati quindici mutanti da sottoporre alle analisi di stabilità strutturale: uno conservativo di otto residui e uno esteso di quaranta residui. I mutanti derivanti dal taglio esteso hanno mostrato una stabilità strutturale soddisfacente a tutte le temperature rispetto ad A14, consentendo l’individuazione di due candidati promettenti da poter sottoporre a test sperimentali. In aggiunta, sono stati selezionati anche i due migliori mutanti ottenuti dal taglio conservativo sulla base dei soli risultati ottenuti a 300K, unica condizione in cui hanno mantenuto una stabilità migliore di A14. I quattro mutanti individuati verranno testati al Latvian Institute of Organic Synthesis (LIOS) a Riga.