Shining light on bacteria electrophysiology through non-genetic optostimulation

Bacterial electrophysiology remains a largely underexplored frontier, limited by the constraints of traditional genetic and electrophysiological tools. This dissertation introduces and validates a novel, non-genetic methodology to modulate and study bacterial membrane potential using synthetic azobenzene-based photoswitches and light as both a trigger and a readout mechanism. Two molecules - Ziapin2 and NO₂-2Pyr, a Push-Pull molecule - were investigated for their capacity to integrate into the Bacillus subtilis plasma membrane and influence electrophysiological behavior upon 470 nm light stimulation. Ziapin2 induces hyperpolarization via a reversible membrane-thickness change mechanism and involves ion channel activation, particularly the YugO potassium channel. NO₂-2Pyr, characterized by a strong intramolecular dipole and push-pull behavior, modulates membrane potential through dipole moment variation upon photoisomerization, triggering transient depolarization events. Both molecules allowed for high-resolution, non-invasive probing of bacterial bioelectricity. The results reveal the central role of potassium and chloride ion fluxes in membrane potential dynamics and uncover previously uncharacterized active and passive ion transport mechanisms. Furthermore, a light-driven modulation of antibiotic efficacy was demonstrated, highlighting a potential route to influence antimicrobial susceptibility. These findings position light-assisted, non-genetic optostimulation as a powerful platform for advancing microbial bioelectric research and engineering.

L'elettrofisiologia batterica rimane un ambito in gran parte inesplorato, limitato dai vincoli degli strumenti genetici ed elettrofisiologici tradizionali. Questa tesi introduce e convalida una metodologia innovativa e non genetica per modulare e studiare il potenziale di membrana nei batteri, utilizzando fotoswitch sintetici a base di azobenzene e la luce come meccanismo sia di attivazione sia di lettura. Sono state analizzate due molecole – Ziapin2 e NO₂-2Pyr, una molecola Push-Pull – per la loro capacità di integrarsi nella membrana plasmatica di Bacillus subtilis e influenzare il comportamento elettrofisiologico in risposta a una stimolazione luminosa a 470 nm. Ziapin2 induce iperpolarizzazione attraverso un meccanismo reversibile di variazione dello spessore della membrana e coinvolge l'attivazione di canali ionici, in particolare il canale del potassio YugO. NO₂-2Pyr, caratterizzata da un forte dipolo intramolecolare e comportamento push-pull, modula il potenziale di membrana attraverso la variazione del momento dipolare in seguito alla fotoisomerizzazione, provocando eventi transitori di depolarizzazione. Entrambe le molecole hanno permesso un’analisi non invasiva e ad alta risoluzione della bioelettricità batterica. I risultati rivelano il ruolo centrale dei flussi di ioni potassio e cloruro nella dinamica del potenziale di membrana e portano alla luce meccanismi di trasporto ionico attivi e passivi finora non caratterizzati. Inoltre, è stata dimostrata una modulazione dell'efficacia degli antibiotici guidata dalla luce, suggerendo una potenziale via per influenzare la suscettibilità antimicrobica. Questi risultati pongono la foto-stimolazione non genetica assistita dalla luce come una piattaforma promettente per l’avanzamento della ricerca e dell’ingegneria bioelettrica microbica.