Oesophageal tissue engineering: optimisation of stereotactic robotic cell injection into decellularised oesophageal scaffolds

Oesophageal atresia (OA) is a rare congenital condition in which the oesophagus is not connected to the stomach, requiring surgical correction shortly after birth. In its most severe form, Long Gap OA (LGOA) primary anastomosis is not feasible due to the long distance between the upper and lower oesophageal ends. Traditional treatments for LGOA often involve the use of sections of stomach, colon, or small bowel, which may lead to complications and reduced quality of life. Tissue engineering (TE) offers a promising solution for the treatment of LGOA. Previous studies in our group established a personalised, size-matched TE approach using decellularised porcine oesophagi as scaffolds, repopulated with mesoangioblasts, MABs, and fibroblasts, FBs and matured in custom-made bioreactors before transplantation. These grafts were successfully implanted in minipigs, achieving 100% survival at 30 days post- transplantation. Building on this work, we aim to advance toward translational clinical application by addressing key challenges: improving cell delivery via robotic microinjection to standardise cell distribution; and replacing the glass decellularisation chamber with a Good Manufacturing Practices (GMP)-compliant polytetrafluoroethylene (PTFE) system. Human MABs and FBs were isolated from Sistrunk and rectus abdominis biopsies, characterised and subsequently used for seeding in decellularised oesophageal scaffolds. A series of trials were performed to optimise a robotic cell seeding method using the stereotactic Neurostar platform, aimed at replacing the manual seeding procedure from previous studies, which was time-consuming and operator dependent. Effective seeding was achieved by calibrating key parameters, including injection depth, to target the inner tissue layers. Cells injected with the robotic platform remained viable and distributed within the scaffold, with outcomes comparable to manual injection. Automated robotic injection provides a reliable and reproducible alternative to manual methods, reducing operator bias while improving precision and standardisation. In parallel, comparative study was conducted to evaluate oesophageal decellularisation performed in glass versus PTFE chambers. Decellularisation outcomes, including DNA, ECM, histology, and mechanics, were overall comparable in both systems, confirming effective scaffold generation and supporting GMP-compliant PTFE chambers as a possible alternative to glass. Together, these advances support the development of TE-oesophageal grafts and establish a foundation for future studies focused on long-term graft maturation and clinical translation.

L’atresia esofagea (OA) è una rara condizione congenita in cui l’esofago non è connesso allo stomaco, richiedendo una correzione chirurgica poco dopo la nascita. Nella sua forma più grave, la Long Gap OA (LGOA), l’anastomosi primaria non è possibile a causa della lunga distanza tra le estremità superiore e inferiore dell’esofago. I trattamenti tradizionali per la LGOA spesso prevedono l’uso di sezioni di stomaco, colon o intestino tenue, che possono comportare complicazioni e una ridotta qualità della vita. L’ingegneria tissutale (TE) rappresenta una soluzione promettente per il trattamento della LGOA. Studi precedenti nel nostro gruppo hanno sviluppato un approccio TE personalizzato e dimensionato utilizzando esofagi suini decellularizzati come scaffold, ripopolati con mesoangioblasti (MABs) e fibroblasti (FBs), e maturati in bioreattori su misura prima del trapianto. Questi innesti sono stati impiantati con successo nei minipig, raggiungendo una sopravvivenza del 100% a 30 giorni post- trapianto. Partendo da questo lavoro, il nostro obiettivo è avanzare verso l’applicazione clinica traslazionale affrontando sfide chiave: miglioramento della somministrazione cellulare tramite microiniezione robotica per standardizzare la distribuzione delle cellule; e sostituzione della camera di decellularizzazione in vetro con un sistema in politetrafluoroetilene (PTFE) conforme alle normative GMP (Good Manufacturing Practices). I MABs e i FBs umani sono stati derivati da biopsia del dotto tireoglosso (procedura di Sistrunk) e del retto addominale, caratterizzati e successivamente utilizzati per il seeding negli scaffold esofagei decellularizzati. Sono stati condotti una serie di trial per ottimizzare un metodo di seeding cellulare robotico utilizzando la piattaforma stereotassica Neurostar, mirato a sostituire il seeding manuale dei precedenti studi, che risultava lungo e dipendente dall’operatore. Il seeding efficace è stato ottenuto calibrando parametri chiave, tra cui la profondità di iniezione, per raggiungere gli strati interni del tessuto. Le cellule iniettate con la piattaforma robotica sono rimaste vitali e distribuite all’interno dello scaffold, con risultati comparabili alla iniezione manuale. L’iniezione robotica automatizzata rappresenta un’alternativa affidabile e riproducibile ai metodi manuali, riducendo il bias dell’operatore e migliorando precisione e standardizzazione. Parallelamente, è stato condotto uno studio comparativo per valutare la decellularizzazione esofagea effettuata in camere in vetro rispetto a camere in PTFE. I risultati della decellularizzazione, inclusi contenuto di DNA, ECM, analisi istologiche e test meccanici, sono stati complessivamente comparabili in entrambi i sistemi, confermando la efficace generazione di scaffold e supportando le camere per la decellularizzazione in PTFE come possibile alternativa al vetro. Questi progressi supportano lo sviluppo di innesti esofagei ingegnerizzati e pongono le basi per studi futuri focalizzati sulla maturazione a lungo termine degli innesti e sulla loro traduzione clinica.