Development of a compartmentalized culture platform for static and dynamic conditioning of ex vivo corneal tissue

The increasing prevalence of ocular diseases such as glaucoma, age-related macular degeneration, and diabetic retinopathy highlights the need for effective and patient-compliant therapeutic strategies. Topical administration is the preferred route due to its non-invasiveness, yet less than 5% of the applied drug reaches intraocular tissues, primarily because of ocular barriers. Developing predictive and reliable preclinical models is therefore essential to improve drug delivery systems and reduce reliance on animal testing. This thesis aims to establish an ex vivo porcine corneal model integrated within the True-Tissue-on-Platform (TToP) system; a modular micro physiological platform designed to mimic tissue environments. The work included optimization of tissue transport, and preparation; adaptation of the TToP modules to accommodate porcine corneas; and functional analysis of trans-epithelial electrical resistance (TEER), permeability, and transparency. Improvements were achieved by using physiological solution instead of povidone-iodine solution during transport, which preserved epithelial integrity. A novel cutting and mounting technique was developed to obtain dimensionally consistent corneal discs while preventing leakage between compartments. To address tissue swelling and dimensional mismatch, modified cartridge designs were tested, with the Ticker TToP++ providing optimal housing and compartmentalization. Culture protocols further demonstrated that the addition of dextran mitigated swelling, while air–liquid interface (ALI) conditions supported superior barrier properties compared to submerged culture. Functional validation confirmed the feasibility of the static TToP system for permeability studies. TEER measurements indicated maintained barrier integrity, permeability assays with FITC-Dextran demonstrated low molecule transition, and transparency analyses—both qualitative and quantitative—provided novel means of assessing tissue swelling. Preliminary advances were also achieved in the development of a dynamic TToP module, featuring an apical droplet release channel for controlled topical drug application and redesigned basal perfusion for clearance studies. Leakage tests confirmed robust compartmentalization, laying the groundwork for real-time, physiologically representative drug delivery experiments. In conclusion, static TToP system provides reliable functional data, while the dynamic module introduces the potential to replicate in vivo-like dosing regimens. Together, these results establish a strong foundation for advancing ophthalmic drug development and align with the 3Rs principles by reducing the reliance on in vivo animal models.

L’aumento della prevalenza di patologie oculari quali glaucoma, degenerazione maculare senile e retinopatia diabetica sottolinea la necessità di strategie terapeutiche efficaci e facilmente applicabili dai pazienti. La somministrazione topica rappresenta tuttora la via preferenziale grazie alla sua non invasività; tuttavia, meno del 5% del farmaco applicato raggiunge i tessuti intraoculari, a causa delle barriere oculari. Risulta quindi fondamentale lo sviluppo di modelli preclinici predittivi e affidabili, in grado di migliorare la valutazione delle formulazioni oftalmiche e di ridurre l’impiego di modelli animali in vivo. Obiettivo di questa tesi è stato lo sviluppo di un modello corneale ex vivo di origine suina, integrato nella piattaforma True-Tissue-on-Platform (TToP), un sistema microfisiologico modulare progettato per ricreare ambienti tissutali sia in condizioni statiche che dinamiche. L’attività sperimentale ha incluso l’ottimizzazione della catena di approvvigionamento e della preparazione dei tessuti, l’adattamento dei moduli TToP per l’alloggiamento delle cornee suine e la validazione funzionale tramite misure elettrofisiologiche, di permeabilità e di trasparenza. Miglioramenti sono stati ottenuti nella gestione del trasporto, sostituendo il trasporto tramite soluzione di povidone-iodio con sola soluzione fisiologica, al fine di preservare l’integrità epiteliale e migliorare i valori di TEER. È stata inoltre sviluppata una tecnica innovativa di taglio e montaggio per ottenere dischi corneali dimensionalmente consistenti e privi di perdite tra i compartimenti. Per compensare il rigonfiamento dei tessuti e le differenze dimensionali, sono state progettate due varianti del sistema, il Thicker TToP ++ risultata più efficace nell’assicurare compartimentalizzazione e stabilità. Le condizioni di coltura sono state ottimizzate grazie all’aggiunta di destrano, che ha ridotto il rigonfiamento, e alla coltura in interfaccia aria–liquido (ALI), che ha mostrato valori di barriera superiori rispetto alla coltura immersa. La validazione funzionale ha confermato l’idoneità del sistema statico TToP per studi di permeabilità: le misure di TEER hanno dimostrato il mantenimento dell’integrità della barriera, i saggi di permeabilità con FITC-Dextran hanno dimostrato basso passaggio molecolare, e l’analisi della trasparenza—sia qualitativa che quantitativa—ha introdotto un metodo innovativo per valutare il rigonfiamento tissutale. Nonostante la variabilità intra-campione, i risultati ottenuti sono coerenti con i valori riportati in letteratura, confermando la rilevanza fisiologica del modello. Sono stati inoltre avviati sviluppi preliminari del modulo dinamico della piattaforma, comprendenti un canale apicale per l’applicazione controllata di gocce topiche e una camera basale ridisegnata per consentire la perfusione continua. I test di tenuta hanno confermato la robustezza della compartimentalizzazione, ponendo le basi per futuri esperimenti in grado di replicare le condizioni fisiologiche di somministrazione del farmaco. In conclusione, il sistema statico TToP si è dimostrato già in grado di fornire dati funzionali affidabili, mentre il modulo dinamico apre la prospettiva di riprodurre schemi di somministrazione in vivo. Questi risultati costituiscono una solida base per il futuro sviluppo di terapie oftalmiche e contribuiscono all’applicazione dei principi delle 3R, riducendo la necessità di ricorrere a modelli animali in vivo.