Label-free multimodal nonlinear optical technologies for biomedical imaging

Biomedical optical imaging aims to understand the anatomy and function of life by manipulating light and detecting signals originating from light-matter interactions. However, biological specimens are often semi-transparent, thus appearing featureless in conventional optical images. To overcome this, exogenous labels such as fluorophores or chemical stains are routinely introduced to highlight specific molecules or structures. While these strategies have been transformative for cell biology, they can alter natural physiology, perturb dynamic processes, and compromise sample viability, posing important constraints. Label-free imaging, powered by multimodal nonlinear optical (NLO) microscopy, offers a compelling alternative: by exploiting intrinsic optical properties such as molecular vibrations, autofluorescence, scattering, or absorption, it enables noninvasive investigation of biological systems. This approach combines complementary NLO contrast mechanisms to access chemical specificity and metabolic sensitivity, overcoming the limitations of label-based biomedical optical imaging. This thesis explores the potential of label-free coherent Raman scattering and multiphoton microscopy in different domains of biological discovery and introduces a novel multimodal NLO system, designed as a versatile platform for cutting-edge biomedical research. Using co-registered NLO modalities, I identified label-free biomarkers for therapy-induced senescence (TIS), and characterized their temporal onset in validated in vitro models. Leveraging on these label-free biomarkers, I trained a robust deep learning classifier that discriminates TIS versus proliferating cells from a limited multimodal dataset. Harnessing noninvasive multiphoton microscopy, I tracked nanoparticle internalization, cell signaling dynamics, and cancer therapy metabolic responses in human cancer cells. To tackle the challenges of next-gen biomedical research, I designed and built an innovative multimodal NLO microscope. The system integrates an ultrafast, fast-tunable NIR laser with a multi-channel epi- and trans-detection scheme. The optomechanical architecture features rapid galvanometric laser-scanning, motorized x-y tiling for whole-slide imaging, and precise z-stacks acquisitions for volumetric imaging, emphasizing usability, simplicity, and versatility. This work demonstrates the potential of label-free NLO techniques in diverse biomedical domains. The technologies developed here could open new paths for precision medicine, enabling dynamic, noninvasive assessment of treatment effects and facilitating rapid preclinical screening in pathophysiological conditions.

L’imaging ottico biomedico mira a comprendere la struttura e la funzione dei processi naturali manipolando la luce e rilevando i segnali generati dalle interazioni luce-materia. Tuttavia, i campioni biologici sono spesso semitrasparenti e risultano quindi privi di caratteristiche distinguibili nelle immagini ottiche convenzionali. Per ovviare a ciò, si ricorre comunemente a marcatori esogeni come fluorofori o coloranti chimici, che permettono di evidenziare specifiche molecole o strutture. Sebbene queste strategie abbiano rivoluzionato la biologia cellulare, possono alterare la fisiologia naturale, perturbare i processi dinamici e compromettere la vitalità dei campioni, imponendo importanti limitazioni. L’imaging label-free, basato sulla microscopia non lineare multimodale (NLO), rappresenta un’alternativa promettente: sfruttando proprietà ottiche intrinseche come le vibrazioni molecolari, l’autofluorescenza, la diffusione o l’assorbimento della luce, consente l’indagine non invasiva dei sistemi biologici. Questa metodologia combina meccanismi di contrasto NLO complementari, offrendo specificità chimica e sensibilità metabolica e superando i limiti delle tecniche ottiche biomediche basate su marcatori. Questa tesi esplora il potenziale della microscopia coerente Raman e multifotone label-free in diversi ambiti della ricerca biologica e introduce un innovativo sistema NLO multimodale, progettato come piattaforma versatile per la ricerca biomedica avanzata. Attraverso modalità NLO co-registrate, ho identificato biomarcatori label-free della senescenza indotta da terapia (TIS) e ne ho caratterizzato la comparsa temporale in modelli in vitro validati. Sfruttando questi biomarcatori, ho sviluppato un classificatore di deep learning in grado di distinguere con elevata accuratezza cellule TIS da cellule proliferanti, anche a partire da dataset multimodali di dimensioni limitate. Utilizzando microscopia multifotone non invasiva, ho inoltre monitorato l’internalizzazione di nanoparticelle, le dinamiche di segnalazione cellulare e le risposte metaboliche a trattamenti antitumorali in cellule umane. Per affrontare le nuove sfide della ricerca biomedica, ho progettato e realizzato un innovativo microscopio NLO multimodale. Il sistema integra un laser NIR ultraveloce a lunghezza d’onda rapidamente variabile con un sistema di acquisizione dei segnali multicanale con illuminazione epi e in transmissione. L’architettura optomeccanica include una scansione laser galvanometrica ad alta velocità, una piattaforma motorizzata x–y per l’imaging su larga area e un controllo preciso dell’asse z per acquisizioni volumetriche, con un’enfasi particolare su usabilità, semplicità e versatilità. Questo lavoro dimostra il potenziale delle tecniche NLO label-free in molteplici ambiti biomedici. Le tecnologie sviluppate in questa tesi aprono nuove prospettive per la medicina di precisione, consentendo una valutazione dinamica e non invasiva degli effetti terapeutici e facilitando uno screening preclinico rapido in condizioni fisiopatologiche reali.