Sviluppo e valutazione preclinica di un nanogel polimerico per la neuroprotezione e la preservazione oligodendrogliale nel trattamento del trauma spinale

Spinal cord injury (SCI) triggers severe secondary degeneration, marked by high vulnerability and apoptosis in neurons and oligodendrocytes (OLs). OL loss leads to demyelination, impaired axonal conduction, and chronic neurological deficits. This process is exacerbated by the inflammatory milieu, microglial polarization (M1), and accumulating myelin debris, highlighting the urgent need for targeted neuroprotection in the acute/subacute phases. We address this by developing a biocompatible PEG-Jeffamine nanogel (PEG-JEFF-RhB), synthesized via a multi-step process involving epichlorohydrin-mediated PEG activation, azide installation, and subsequent click-chemistry conjugation with low-cytotoxicity Jeffamine. Successful functionalization was confirmed by 1H-NMR spectroscopy. The nanogel was characterized as a drug-delivery platform for atorvastatin (ATOR), a known neuroprotectant. Dynamic Light Scattering (DLS) confirmed its nanometric size, good homogeneity, and electro-steric stability in aqueous media. Drug-loading capability and release kinetics, assessed using Rhodamine B (RhB) as a mimetic probe, demonstrated a controlled, time-dependent release profile with a manageable initial burst. In mixed primary spinal cord cultures, immunofluorescence and cell counting verified the population composition. PEG-JEFF-RhB exhibited excellent biocompatibility (optimal at 1:500 dilution) and was immunologically inert (iNOS and TNFα expression matching controls, not LPS). Quantitative analysis of the RhB signal demonstrated efficient cellular internalization across all neural populations, crucially including OLs. Pharmacological efficacy of the nanogel-loaded ATOR (NG +ATOR) was then evaluated against free ATOR under equivalent concentrations and H2O2 induced oxidative stress. NG+ ATOR at 0.001µM significantly attenuated apoptosis (reduced caspases and BAX/BCL2 ratio), preserved overall viability, and crucially, increased the number of viable oligodendrocytes compared to the free drug. Imaging analysis further corroborated these findings by showing a more intact myelin basic protein (MBP) network. Collectively, the PEG-JEFF-RhB nanogel proves to be a robust, biocompatible, and non-pro-inflammatory system with efficient cellular uptake. Its enhanced protective effects against OL loss and its ability to sustain its enhanced protective effects against OL loss and its ability to sustain axonal function under oxidative stress making it a highly promising platform for targeted, localized ATOR delivery in the acute post-SCI setting.

Dopo una lesione del midollo spinale (LMS), neuroni e oligodendrociti (OL) diventano altamente vulnerabili: l’apoptosi/necrosi degli OL causa demielinizzazione, rallenta la conduzione assonale e alimenta la degenerazione secondaria; le cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) tentano la riparazione, ma cicatrice gliale e microambiente infiammatorio ne limitano differenziamento e remielinizzazione. La polarizzazione microgliale (M1) e i detriti mielinici contribuiscono alla perdita di OL, evidenziando la necessità di interventi mirati a proteggere queste cellule e il tessuto neuronale nelle fasi acute/subacute. In questo lavoro è stato sviluppato e caratterizzato in vitro un nanogel PEG–Jeffamine funzionalizzato con Rodamina B (PEG-JEFF-RhB) come piattaforma di drug delivery per atorvastatina (ATOR), con l’obiettivo di attenuare apoptosi e perdita oligodendrogliale. La sintesi ha seguito un processo multi-step: attivazione del PEG mediata da epicloridrina, introduzione di gruppi azide e coniugazione tramite click chemistry con Jeffamine, polietereammina ad elevata biocompatibilità e bassa citotossicità. L’avanzamento della funzionalizzazione è stato confermato mediante spettroscopia ¹H-NMR. La caratterizzazione fisico-chimica, avvenuta attraverso la tecnica di dynamic light scattering (DLS), ha evidenziato dimensioni nanometriche, buona omogeneità e stabilità elettro-sterica in ambiente acquoso. È stata quindi valutata la capacità di incapsulare farmaci e la cinetica di rilascio del composto è stata valutata impiegando la Rodamina B come molecola farmaco mimetica dimostrandone la capacità di rilascio nel tempo. La capacità del NG di essere internalizzato è stata condotta su colture primarie miste di midollo spinale, e la biocompatibilità è stata valutata mediante saggi di vitalità cellulare ed espressione genica di marker pro-infiammatori. Il NG ha mostrato internalizzazione in diverse popolazioni cellulari, quali microglia, astrociti, neuroni e anche OL, nonostante la loro bassa capacità fagocitica. L’efficacia farmacologica del sistema (NG+ATOR) è stata valutata con diverse concentrazioni di ATOR in un modello cellulare di apoptosi indotta mediante H₂O₂. Il trattamento con NG+ATOR (0,001 µM) ha determinato una diminuzione dell’apoptosi, come dimostrato sia dalla significativa riduzione delle caspasi attive che dalla modulazione dei geni BAX e BCL2 (diminuzione di BAX, aumento di BCL2 e conseguente calo del rapporto BAX/BCL2). Tali effetti pro-sopravvivenza sono stati accompagnati da un incremento della vitalità complessiva e da un aumento significativo del numero di OL in coltura rispetto al farmaco libero alla stessa dose. I risultati ottenuti in questo lavoro dimostrano che il NG PEG-Jeffamine/ATOR rappresenta una piattaforma di drug delivery altamente promettente per contrastare il danno e la perdita oligodendrogliale. Questo sistema non solo incapsula e rilascia l'ATOR in modo efficiente, ma è anche in grado di raggiungere le cellule bersaglio e di esercitare un significativo effetto protettivo a concentrazioni efficaci. Tali evidenze aprono la strada a futuri studi in vivo per validare il potenziale terapeutico di questo nanogel nel trattamento di patologie neurodegenerative o di lesioni del sistema nervoso centrale caratterizzate da danno oligodendrogliale e demielinizzazione.