SOD-PDMAEMA bioconjugates as a model platform towards intracellular protein delivery

Intracellular protein delivery remains a major bottleneck for fully exploiting therapeutic proteins, largely due to poor membrane permeability and endolysosomal sequestration. Cationic polymers such as poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] (PDMAEMA) have emerged as promising carriers to enhance cellular uptake and endosomal escape when covalently grafted onto protein therapeutics. In this work, bovine Cu–Zn superoxide dismutase (SOD) was employed as a structurally well-characterized model enzyme to investigate the design and physicochemical characterization of SOD–P(DMAEMA₃₅-co-RhBMA) conjugates for intracellular delivery. In particular, the protein and polymer contents were quantified by bicinchoninic acid (BCA) assay and UV–Vis spectrophotometry. This estimate provided an experimental SOD:copolymer stoichiometry that could be directly compared with the apparent molecular weights (Mw) obtained by electrophoresis. However, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE) results for SOD–PDMAEMA conjugates were unreliable, showing inconsistently elevated Mw. This anomalous behavior was attributed to strong electrostatic complexation between the highly cationic PDMAEMA corona and SDS, which perturbs charge normalization and leads to overestimation of the samples’ Mw. To overcome this limitation, acetic acid–urea PAGE (AU–PAGE), operated under acidic, detergent-free conditions, was employed as an alternative electrophoretic method. AU–PAGE bands and smear patterns were representative of the distribution of conjugate species and their relative grafting degree. However, intertwined dependence on charge and size prevents a direct conversion of migration distance into Mw, limiting this method to a qualitative readout. Further work could implement a cationic detergent system (e.g., CTAB) to homogenize the positive charge of the conjugates and convert AU–PAGE into a quantitative, size-based analysis. In parallel, cellular investigations will benchmark SOD–P(DMAEMA₃₅-co-RhBMA) against non-cationic controls via cytotoxicity assays, fluorescence co-localization to assess uptake and endosomal escape, and measurements of intracellular SOD activity.

La veicolazione intracellulare di proteine terapeutiche rappresenta un limite critico per il loro pieno sfruttamento, principalmente a causa della scarsa permeabilità di membrana e del sequestro endolisosomiale. I polimeri cationici, come la poli[2-(dimetilammino)etil metacrilato] (PDMAEMA), sono emersi come vettori promettenti per migliorare l’uptake cellulare e la fuga endosomiale quando vengono coniugati covalentemente a proteine terapeutiche. In questo lavoro, la Cu–Zn superossido dismutasi bovina (SOD) è stata utilizzata come enzima modello per lo studio della progettazione e della caratterizzazione chimico-fisica di coniugati SOD–P(DMAEMA₃₅-co-RhBMA) destinati al rilascio intracellulare. In particolare, i contenuti di proteina e polimero sono stati quantificati tramite saggio dell’acido bicinconinico (BCA) e spettrofotometria UV–Vis. Questa stima ha fornito una stechiometria sperimentale SOD:copolimero confrontabile con i pesi molecolari (PM) apparenti ottenuti con l’elettroforesi su gel di poliacrilammide con dodecilsolfato di sodio (SDS–PAGE). Tuttavia, i risultati dell’SDS-PAGE per i coniugati SOD–PDMAEMA si sono rivelati inaffidabili, mostrando PM aumentati non coerenti con le aspettative. Questo comportamento anomalo è stato attribuito alla forte complessazione elettrostatica tra la corona altamente cationica di PDMAEMA e l’SDS, che altera la normalizzazione della carica e porta a una sovrastima del PM dei campioni. Per superare questo limite, l’elettroforesi con acido acetico e urea (AU–PAGE), condotta in condizioni acide e prive di detergente, è stata impiegata come metodo elettroforetico alternativo. Le bande e i pattern diffusi osservati in AU–PAGE risultano rappresentativi della distribuzione delle specie coniugate e del loro grado di coniugazione. Tuttavia, la dipendenza congiunta da carica e dimensioni impedisce una conversione diretta della distanza di migrazione in PM, limitando questo metodo a una misura qualitativa. Sviluppi futuri potrebbero implementare un sistema con detergente cationico (ad es. CTAB) per omogeneizzare la carica positiva dei coniugati e convertire l’AU–PAGE in un’analisi quantitativa basata sulle dimensioni. In parallelo, studi cellulari metteranno a confronto SOD–P(DMAEMA₃₅-co-RhBMA) con controlli non cationici mediante saggi di citotossicità, co-localizzazione in fluorescenza per valutare uptake e fuga endosomiale, insieme a misurazioni dell’attività intracellulare della SOD.