Investigation of the role of the mechanoreceptor PIEZO1 in the migration and invasion capacity of U-251MG glioblastoma cells

Glioblastoma (GBM) is the most aggressive primary tumour of the central nervous system and is characterized by pronounced invasiveness and diffuse infiltration into surrounding brain tissue, which severely limits the effectiveness of current therapeutic strategies. Increasing evidence suggests that mechanosensitive signalling pathways play a key role in regulating glioblastoma cell behaviour within the complex and mechanically heterogeneous brain microenvironment. Among these pathways, the mechanosensitive ion channel PIEZO1 has emerged as a potential regulator of tumour cell migration and invasion; however, its functional contribution to these processes remains incompletely understood. The aim of this thesis was to investigate the role of PIEZO1 overexpression in glioblastoma invasion and migration using complementary in vitro assays combined with custom-developed image analysis pipelines. Genetically matched U-251 glioblastoma cell models with and without endogenous PIEZO1 overexpression were employed to ensure that observed phenotypic differences could be specifically attributed to PIEZO1 modulation. Two established in vitro approaches were used: a fluorescent gelatin Matrix Degradation Assay to assess extracellular matrix remodelling, and an In vitro Scratch Assay to evaluate collective cell migration. Both assays were coupled to tailored MATLAB-based image analysis workflows designed to enable reproducible segmentation, quantitative measurement, and direct visual validation. Quantitative analysis of the matrix degradation assay demonstrated that PIEZO1-overexpressing cells exhibit a significantly enhanced capacity to degrade the extracellular matrix compared to control cells. Increased total degraded gelatin area, higher degradation normalized to image and total cell area, and elevated degradation activity per cell were consistently observed. These findings support a more proteolytic and invasive phenotype, likely associated with invadopodia-mediated matrix remodelling. In parallel, Scratch Assay analysis revealed greater wound closure dynamics in PIEZO1-overexpressing cells relative to controls over a 24-hour period, indicating enhanced collective wound-filling behaviour. While this assay reflects a combination of migration and proliferation, the observed differences are consistent with an overall increase in motile capacity in PIEZO1-overexpressing cells. From a methodological standpoint, this work establishes robust and flexible image analysis pipelines that enable objective quantification of invasion- and migration-related parameters from microscopy data. Although certain limitations were identified, such as operator dependence in manual region selection and restricted spatial interpretation due to nuclear-only staining, the analytical framework proved reliable for comparative analysis between experimental groups. In conclusion, this thesis provides experimental and quantitative evidence linking PIEZO1 overexpression to increased invasive and migratory behaviour in glioblastoma cells. By integrating biologically relevant in vitro assays with customized computational analysis, this work contributes to a deeper understanding of mechanosensitive regulation in glioblastoma progression and lays the groundwork for future mechanistic and translational studies.

Il glioblastoma (GBM) è il tumore primario più aggressivo del sistema nervoso centrale ed è caratterizzato da una spiccata invasività e da una diffusa infiltrazione nel tessuto cerebrale circostante, fattori che limitano fortemente l’efficacia delle attuali strategie terapeutiche. Un numero crescente di evidenze indica che le vie di segnalazione meccanosensibili svolgano un ruolo chiave nella regolazione del comportamento delle cellule di glioblastoma all’interno del complesso e meccanicamente eterogeneo microambiente cerebrale. Tra queste vie, il canale ionico meccanosensibile PIEZO1 è emerso come un potenziale regolatore della migrazione e dell’invasione delle cellule tumorali; tuttavia, il suo contributo funzionale a tali processi non è ancora completamente chiarito. L’obiettivo di questa tesi è stato quello di indagare il ruolo della sovraespressione di PIEZO1 nell’invasione e nella migrazione del glioblastoma, utilizzando saggi in vitro complementari combinati con pipeline di analisi delle immagini sviluppate ad hoc. A tal fine, sono stati impiegati modelli cellulari di glioblastoma U-251 geneticamente modificati, con e senza sovraespressione endogena di PIEZO1, al fine di garantire che le differenze fenotipiche osservate potessero essere attribuite specificamente alla modulazione di PIEZO1. Sono stati utilizzati due approcci in vitro consolidati: un saggio di degradazione della matrice di gelatina fluorescente per valutare il rimodellamento della matrice extracellulare e un saggio di scratch in vitro per analizzare la migrazione cellulare collettiva. Entrambi i saggi sono stati integrati con flussi di lavoro di analisi delle immagini basati su MATLAB, progettati per consentire una segmentazione riproducibile, una quantificazione accurata e una validazione visiva diretta. L’analisi quantitativa del saggio di degradazione della matrice ha dimostrato che le cellule con sovraespressione di PIEZO1 presentano una capacità significativamente aumentata di degradare la matrice extracellulare rispetto alle cellule di controllo. In particolare, sono stati osservati in modo consistente un incremento dell’area totale di gelatina degradata, una maggiore degradazione normalizzata rispetto all’area dell’immagine e all’area cellulare totale, nonché un’elevata attività di degradazione per cellula. Questi risultati supportano l’esistenza di un fenotipo più proteolitico e invasivo, probabilmente associato a un rimodellamento della matrice mediato dagli invadopodi. Parallelamente, l’analisi del saggio di scratch ha evidenziato una maggiore dinamica di chiusura della ferita nelle cellule con sovraespressione di PIEZO1 rispetto alle cellule di controllo nell’arco di 24 ore, indicando un comportamento collettivo di riempimento della ferita più marcato. Sebbene questo saggio rifletta una combinazione di migrazione e proliferazione, le differenze osservate risultano coerenti con un aumento complessivo della capacità motile. Dal punto di vista metodologico, questo lavoro definisce pipeline di analisi delle immagini robuste e flessibili, in grado di consentire una quantificazione oggettiva di parametri associati ai processi di invasione e migrazione a partire da dati di microscopia. Sebbene siano state identificate alcune limitazioni, quali la dipendenza dall’operatore nella selezione manuale delle regioni di interesse e la limitata interpretazione spaziale dovuta alla colorazione esclusivamente nucleare, il framework analitico si è dimostrato affidabile per l’analisi comparativa tra i gruppi sperimentali. In conclusione, questa tesi fornisce evidenze sperimentali e quantitative che collegano la sovraespressione di PIEZO1 a un aumento del comportamento invasivo e migratorio nelle cellule di glioblastoma. Attraverso l’integrazione di saggi in vitro biologicamente rilevanti e di analisi computazionali personalizzate, questo lavoro contribuisce a una comprensione più approfondita della regolazione meccanosensibile nella progressione del glioblastoma e pone le basi per futuri studi di tipo meccanicistico e traslazionale.