Engineering ROS-scavenging nanogels for drug delivery applications targeting ferroptosis

Ferroptosis is a form of iron-dependent programmed cell death, characterized by excessive production of reactive oxygen species and uncontrolled lipid peroxidation of cellular membranes, specifically involving phospholipids containing polyunsaturated fatty acids. This process has been identified as a crucial mechanism in neurodegenerative disorders. This thesis aims to develop antioxidant molecules capable of scavenging free radicals, with a targeted action on oxidative processes occurring at the membrane interface. Two classes of antioxidant molecules were developed: one belonging to the nitroxide family and the other to the catechol family. The nitroxide radical 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, commonly known as TEMPO, is a molecule with strong antioxidant activity, conferred by the presence of a nitroxyl group bearing an unpaired electron. TEMPO exerts its antioxidant function through a catalytic redox cycle without being consumed in the process. Owing to its molecular structure, TEMPO is both thermodynamically and kinetically stable as a result of electronic and steric effects. However, the use of TEMPO presents several limitations, including rapid clearance from the body and limited ability to cross biological barriers, due to its high water solubility. The second class of antioxidant molecules investigated comprises catechols, with particular focus on hydroxytyrosol, characterized by the presence of two hydroxyl groups in respective ortho position on the aromatic ring. Its antioxidant activity arises from the high electron density on the oxygen atoms, which enables hydrogen atom transfer to radical species. Its effectiveness is also attributed to its amphiphilic nature, allowing interaction in both aqueous and lipid environments, such as those in proximity to cellular membranes, which are primary targets of oxidative damage. Nevertheless, hydroxytyrosol exhibits high reactivity and pronounced susceptibility to oxidative degradation, limiting its stability and efficacy. To overcome these limitations, stable nanogels were developed by combining polyethylene glycol (PEG) and linear polyethyleneimine (PEI). To incorporate TEMPO and hydroxytyrosol into the nanogel formulation, specific linkers containing TEMPO (TEMPO-acetyl bromide) and chlorine-activated hydroxytyrosol were synthesised and subsequently attached to the polymer backbone (grafted) or coated onto the nanogel surface (coated). Furthermore, to perform in vitro studies, the nanogels were conjugated with a fluorescent tracer (Cy5-azide), enabling investigation of their cellular internalization pathways. All nanogels were characterized in terms of physicochemical properties, including hydrodynamic diameter and ζ-potential, by DLS analysis to assess their colloidal stability and surface charge modulation following functionalization. Both TEMPO- and hydroxytyrosol-functionalized systems were successfully characterised at the structural level. Biological and antioxidant evaluations were primarily performed on TEMPO-containing nanogels. MTT assays confirmed their cytocompatibility within relevant concentration ranges, while FRAP and ORAC analyses demonstrated that TEMPO antioxidant moiety retains significant redox activity after immobilization onto the nanocarrier. Notably, the grafting strategy provided higher and more reproducible antioxidant efficiency compared to coating, highlighting the importance of controlled functionalization in optimizing nanogel performance. Overall, the combined structural, biological, and redox characterization supports the potential of antioxidant-functionalized PEG–PEI nanogels as promising platforms for modulating ferroptosis-related oxidative stress.

La ferroptosi rappresenta una forma di morte cellulare programmata dipendente dal ferro, caratterizzata da un’eccessiva produzione di specie reattive dell’ossigeno e da una perossidazione lipidica incontrollata delle membrane cellulari, che coinvolge in modo specifico i fosfolipidi contenenti acidi grassi polinsaturi. Tale processo è stato identificato come un meccanismo cruciale nei disturbi neurodegenerativi. Questa tesi si propone di sviluppare molecole con attività antiossidante, in grado di intercettare i radicali liberi con un’azione mirata ai processi ossidativi a livello dell’interfaccia di membrana. Sono state sviluppate due classi di molecole antiossidanti: una appartenente alla famiglia dei nitrossidi e una alla famiglia dei catecoli. Il radicale nitrossido 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, comunemente noto come TEMPO, è una molecola dotata di una potente attività antiossidante, conferita dalla presenza di un gruppo nitrossile con un elettrone spaiato. TEMPO svolge la sua funzione attraverso un ciclo redox catalitico senza essere consumato nel processo. Grazie alla sua struttura, risulta stabile sia dal punto di vista termodinamico che cinetico, per effetto di fattori elettronici e sterici. Tuttavia, l’impiego del TEMPO presenta alcuni limiti, tra cui la rapida eliminazione dall’organismo e la difficoltà di attraversamento delle barriere biologiche, dovuti alla sua elevata solubilità in acqua. L’altra classe di molecole antiossidanti considerata è quella dei catecoli, in particolare l’idrossitirosolo, caratterizzato dalla presenza di due gruppi ossidrilici in posizione orto sull’anello aromatico. La sua attività antiossidante deriva dall’elevata densità elettronica sugli atomi di ossigeno, che consente il trasferimento di un atomo di idrogeno alle specie radicaliche. La sua efficacia è inoltre legata alla natura anfifilica, che ne favorisce l’interazione sia in ambiente acquoso sia in ambiente lipidico, come quello in prossimità delle membrane cellulari, principali bersagli del danno ossidativo. Tuttavia, l’idrossitirosolo presenta un’elevata reattività e una marcata suscettibilità a processi di degradazione ossidativa, che ne limitano la stabilità e l’efficacia. Per superare tali limitazioni, sono stati sviluppati nanogel stabili ottenuti dalla combinazione di polietilenglicole (PEG) e polietilenimina (PEI) lineare. Per l’introduzione del TEMPO e dell’idrossitirosolo nella formulazione dei nanogel, sono stati sintetizzati specifici linker contenenti TEMPO (TEMPO-acetilbromuro) e idrossitirosolo attivato mediante cloro, successivamente legati al polimero (grafted) o rivestiti sulla superficie dei nanogel (coated). Inoltre, per condurre studi in vitro, i nanogel sono stati coniugati a un tracciante fluorescente (Cy5-azide), che ha permesso di analizzarne il processo di internalizzazione cellulare. Tutti i nanogel sono stati caratterizzati dal punto di vista fisico-chimico, includendo il diametro idrodinamico e il potenziale ζ, mediante analisi DLS, al fine di valutarne la stabilità colloidale e la modulazione della carica superficiale in seguito alla funzionalizzazione. Sia i sistemi funzionalizzati con TEMPO sia quelli con idrossitirosolo sono stati validati con successo a livello strutturale. Le valutazioni biologiche e dell’attività antiossidante sono state condotte principalmente sui nanogel contenenti TEMPO. I saggi MTT hanno confermato la loro citocompatibilità nell’intervallo di concentrazione rilevante, mentre le analisi FRAP e ORAC hanno dimostrato che la molecola antiossidante mantiene una significativa attività redox dopo l’immobilizzazione sul nanocarrier. In particolare, la strategia di grafting ha mostrato un’efficienza antiossidante superiore e più riproducibile rispetto al coating, evidenziando l’importanza di una funzionalizzazione controllata per ottimizzare le prestazioni dei nanogel. Complessivamente, la caratterizzazione strutturale, biologica e redox supporta il potenziale dei nanogel PEG–PEI funzionalizzati con antiossidanti come piattaforme promettenti per la modulazione dello stress ossidativo correlato alla ferroptosi.