Focused ultrasound-induced acoustic cavitation for bacterial biofilm disruption: design of an in vitro experimental setup for preliminary studies

This work addresses a major global health challenge: the increasing resistance of bacteria to antibiotics, whose key contributor is the presence of bacterial biofilms, communities embedded in a self-produced extracellular polymeric substance (EPS) that limits antibiotic penetration and promotes chronic infections. Conventional chemical treatments are often ineffective against biofilms and, as a result, innovative physical strategies are needed. Among these, Focused Ultrasound (FUS) has emerged as a promising mechanical approach to disrupt biofilms and enhance antibiotic delivery via ultrasound-induced acoustic cavitation, in which microbubbles oscillate, grow and collapse under ultrasonic exposure. Two cavitation regimes exist: stable (controlled oscillations) and inertial (violent collapses). This project aims to investigate the correlation between cavitation activity and its biological effects on biofilms. Although the antibacterial effectiveness of cavitation is well supported in the literature, real-time monitoring has rarely been performed and when done, it focused on inertial cavitation. However, inertial cavitation, despite being effective, poses risks for in vivo applications in sensitive areas due to the risk of life-threatening damage such as haemorrhage. To address this, the general, final objective of this work is to develop a portable, complete in vitro setup that allows inducing cavitation and its monitoring in bacterial cultures using detectors such as a Passive Cavitation Detector (PCD) and a hydrophone. The work involved identifying a suitable well-plate, performing its acoustic characterization to evaluate its effect on ultrasound propagation, inducing cavitation using SonoVue® microbubbles and analysing the signals in MATLAB, including spectral analysis via Fourier Transform. A biofilm cultivation protocol for Pseudomonas aeruginosa (PAO1, WT) was optimized and validated in vitro, enabling preliminary experiments directly on biofilms: these tests showed that the experimental setup is fully operational and biological outcomes are observable under both stable and inertial cavitation regimes, providing a starting point for further investigations into safe and effective biofilm disruption for antibiotic therapies.

Questo lavoro si occupa di una problematica chiave per la salute globale: l’aumento della resistenza batterica agli antibiotici. La formazione di biofilm, strutture complesse costituite da comunità microbiche organizzate e incorporate in una matrice polimerica extracellulare autoprodotta (EPS), rappresenta un fattore chiave nello sviluppo della resistenza batterica. Tale matrice, infatti, funge da barriera protettiva e riduce significativamente la penetrazione degli antibiotici, favorendo, quindi, la persistenza di infezioni croniche. I trattamenti chimici convenzionali si sono spesso rivelati inefficaci contro i biofilm, evidenziando la necessità di strategie alternative basate su approcci fisici innovativi. Tra queste, l’utilizzo di ultrasuoni focalizzati (Focused Ultrasound, FUS) rappresenta una soluzione promettente, in grado non solo di indurre la distruzione dei biofilm, ma anche di potenziare l'efficacia della somministrazione di antibiotici. Questo trattamento si basa sul fenomeno della cavitazione acustica indotta dagli ultrasuoni, durante il quale microbolle oscillano, crescono e infine collassano in risposta all’esposizione ultrasonica. Tale fenomeno può manifestarsi in due diversi regimi: la cavitazione stabile, caratterizzata da oscillazioni regolari e controllate, e la cavitazione inerziale, contraddistinta da collassi rapidi e violenti, in grado di generare sollecitazioni meccaniche intense. L’obiettivo di questo progetto è indagare la correlazione tra l’attività di cavitazione e i suoi effetti biologici sui biofilm. Nonostante l’efficacia antibatterica della cavitazione sia ampiamente documentata in letteratura, il monitoraggio in tempo reale è stato raramente implementato e, quando presente, si è concentrato prevalentemente sulla cavitazione inerziale che, pur risultando efficace, presenta limitazioni significative per le applicazioni in vivo, in particolare in aree sensibili, a causa del potenziale rischio di provocare danni gravi ai tessuti, come le emorragie. Per affrontare questo aspetto, il presente lavoro ha avuto come obiettivo lo sviluppo di un setup in vitro portatile e integrato, in grado sia di indurre la cavitazione, sia di monitorarne l’attività in colture cellulari. A tale scopo, sono stati impiegati diversi sistemi di rilevazione, tra cui un Passive Cavitation Detector (PCD) e un idrofono. Il lavoro ha previsto la selezione di una piastra per colture cellulari e la sua caratterizzazione acustica, con il fine di valutarne l’influenza sulla propagazione degli ultrasuoni. La cavitazione è stata indotta tramite microbolle di contrasto (SonoVue®) e i segnali acquisiti sono stati analizzati con MATLAB attraverso l’analisi spettrale basata sulla trasformata di Fourier. È stato, inoltre, validato in vitro un protocollo di coltivazione di biofilm di Pseudomonas aeruginosa (PAO1, WT), che ha permesso di condurre esperimenti preliminari direttamente sui biofilm. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il setup sperimentale è pienamente operativo e che effetti biologici sono osservabili sia nel regime di cavitazione stabile, sia in quello inerziale, fornendo una base per studi futuri finalizzati allo sviluppo di strategie sicure ed efficaci per la distruzione dei biofilm, a supporto delle terapie antibiotiche.