Design of poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) for intracellular delivery of nucleic acids and proteins

Protein-based therapeutics and nucleic acid delivery have drawn increasing interest for the treatment of various pathologies, including cancer and genetic disorders. However, their therapeutic potential is limited by poor membrane permeability, as the targets of these molecules are located within the cytosol. Therefore, the development of efficient intracellular delivery strategies is essential to facilitate cellular uptake and therefore improve the therapeutic efficacy of these compounds. Amongthecurrent approaches, cationic polymers like poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) (PDMAEMA) have gained attention due to their versatile synthesis and buffering capacity, which facilitates endosomal escape via the proton-sponge effect. This thesis work aims at the design and characterization of a versatile PDMAEMA-based delivery platform. A library of linear and 4-arm PDMAEMA homopolymers and fluorescent copolymers was successfully synthesized via Atom Transfer Radical Polymerization (ATRP). The first part of the study focused on the design, synthesis, and characterization of different polymeric architectures for potential nucleic acid delivery applications. In particular, 4-arm polymers were designed to facilitate complexation with such molecules. However, an evaluation of their transfection efficiency is required in future investigations. Additionally, the study included the development of protein-polymer bioconjugates using Superoxide Dismutase (SOD) as a model therapeutic enzyme. SOD was conjugated to PDMAEMA via Copper(I)-catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC) using a "grafting to" approach. Gel Electrophoresis and absorbance-based protein and polymer quantification confirmed that intermediate protein-polymer ratios yield high conjugation efficiencies, while also showing that longer polymer chains limit grafting density due to steric hindrance. These results confirm the feasibility of the proposed synthesis and characterization methods for PDMAEMA-based carriers for nucleic acid and protein delivery. Nevertheless, future studies are necessary to evaluate cytotoxicity, optimize delivery efficiency, and verify the biological performance of these bioconjugates.

Le terapie basate sulle proteine e sul rilascio intracellulare di acidi nucleici hanno suscitato un crescente interesse per il trattamento di diverse patologie, tra cui il cancro e le malattie genetiche. Tuttavia, il loro potenziale terapeutico è limitato dalla loro scarsa permeabilità di membrana, poiché i bersagli di queste molecole sono situati all’interno del citosol. Pertanto, lo sviluppo di strategie di rilascio intracellulare efficaci è essenziale per facilitarne l’internalizzazione e migliorare così l’efficacia terapeutica di questi composti. Tra gli approcci attuali, i polimeri cationici come il poli(2-(dimetilammino)etil metacrilato) (PDMAEMA) hanno attirato l’attenzione grazie alla loro sintesi versatile e al loro effetto tampone del pH (proton-sponge effect), che facilita il rilascio citosolico. Questa tesi mira alla progettazione e alla caratterizzazione di una piattaforma di sistemi di rilascio intracellulare basati sul PDMAEMA. Una libreria di omopolimeri PDMAEMA lineari e a 4 braccia e copolimeri fluorescenti è stata sintetizzata con successo tramite polimerizzazione radicalica per trasferimento atomico (ATRP). La prima parte dello studio si è concentrata sulla progettazione, la sintesi e la caratterizzazione di diverse architetture polimeriche per potenziali applicazioni di rilascio genico. In particolare, i polimeri a 4 braccia sono stati progettati per facilitare la complessazione con gli acidi nucleici, tuttavia è necessaria una valutazione della loro efficienza di trasfezione in indagini future. Inoltre, lo studio ha incluso anche lo sviluppo di bioconiugati proteina-polimero utilizzando la Superossido Dismutasi (SOD) come enzima terapeutico modello. La SOD è stata coniugata al PDMAEMA tramite cicloaddizione azide-alchino catalizzata dal rame(I) (CuAAC) utilizzando un approccio “grafting to”. L’elettroforesi su gel e la quantificazione di proteine e polimeri basata sull’assorbanza hanno confermato che rapporti proteina-polimero intermedi portano a elevate efficienze di coniugazione, evidenziando al contempo che catene polimeriche più lunghe limitano la densità di innesto a causa dell’ingombro sterico. Questi risultati confermano la validità dei metodi di sintesi e caratterizzazione proposti per i vettori a base di PDMAEMA per il trasporto di acidi nucleici e proteine. Pertanto, futuri studi sono necessari per valutare la citotossicità dei sistemi, ottimizzare l’efficacia del trasporto intracellulare e verificare l’attività terapeutica dei bioconiugati.