Protocol optimization and device testing to evaluate red blood cells as drug delivery systems

Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) is an aggressive form and one of the most common types of Non-Hodgkins Lymphoma (NHL), with an estimate of 150,000 new cases annually worldwide, representing almost 30% of all case. Currents treatments, that combine chemotherapy and immunotherapy, are still not optimal in terms of therapeutic effectiveness, since the 40% of cases are refractory or relapsed after treatment. An innovative therapeutic approach uses Red Blood Cells (RBCs) as drug carriers to obtain a drug’s controlled release and a reduced drug toxicity. Following this direction, a microfluidic chip that exploits stresses on RBCs’ membrane to encapsulate the drug (Gemcitabine) into cells, have been developed at Politecnico di Milano. To study the drug release, static tests are the most common approach, nevertheless they present several limitations. For this reason, a dynamic bioreactor has been developed at Politecnico di Milano in order to replicates an environment closer to the in vivo one. This work has optimized the experimental setup and the last version of the bioreactor from a technological point of view. The quantity of blood and plasma needed to carry out a complete test (static + dynamic) was drastically reduced to open to the possibility of performing three complete tests in parallel allowing to try different conditions on the same blood. The bioreactor design has been strongly modified to solve problems related to its easiness of use, hydraulic seal and reliability. In parallel, a method to study RBCs’ senescence process after the encapsulation have been optimized. The expression of phosphatidylserine (PS) and CD47 has been measured using flow cytometry. Static and dynamic tests were conducted with both bioreactor versions, to assess their reliability and confirm the introduced improvements. Using tests’ results, an interpretative model has been fitted to determine the quantity of Gemcitabine released by RBCs. Finally, a comparison, in terms of loading capacity, has been performed between two loading chips developed at Politecnico di Milano. The technological part of this work was conducted at the LaBS Artificial Organs laboratory at Politecnico di Milano. While all the biological tests and the flow cytometric analyses were carried out at the Humanitas Research Hospital. The modifications apported to the bioreactor and to protocols have clearly improved the reliability and consistency of the system, as well as reduced the blood waste. Moreover, the new system allows for further technological improvements thanks to its scalability and convenient design. The development of a pressure driven method to replace the medium in the bioreactor has been suggested. Finally, A totally new approach could be considered and validated using the Bioreactor standard. Developing a Tumor-on-Chip (ToC) system would not only reduce the amount of reagents needed, but would allow us to observe the processes involved more closely and introduce other cell types to better replicate the affected tumor environment.

Il linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) è una forma aggressiva e uno dei tipi più comuni di Linfoma Non-Hodgkins (NHL), con una stima di 150.000 nuovi casi annuali in tutto il mondo, rappresentando quasi il 30% di tutti i casi. I trattamenti attuali, che combinano chemioterapia e immunoterapia, non risultano ottimali in termini di efficacia terapeutica, con il 40% dei pazienti che risultano refrattari o recidivanti dopo il trattamento. Un approccio terapeutico innovativo prevede di utilizzare i globuli rossi come trasportatori dei farmaci, di modo da ottenere un rilascio controllato e una tossicità ridotta a livello sistemico. In questo contesto, il Politecnico di Milano ha sviluppato un chip microfluidico che, causando una deformazione temporanea della membrana dei globuli rossi, permette l’incapsulamento del farmaco (Gemcitabina) all’interno degli stessi. Per studiare il rilascio di un farmaco, i test statici sono il metodo più comune; tuttavia, questo approccio presenta diverse limitazioni, soprattutto se associato all’utilizzo di globuli rossi. Per questo motivo, il Politecnico di Milano ha sviluppato un bioreattore dinamico con lo scopo di replicare le condizioni che i globuli rossi incontrerebbero in vivo e ottenere un comportamento di rilascio più realistico. In questo lavoro di tesi è stato ottimizzato l’apparato sperimentale appena descritto, andando a sviluppare l’ultima versione del bioreattore dal punto di vista tecnologico. La quantità di sangue e plasma necessaria per eseguire un test completo (statico + dinamico) è stata considerevolmente ridotta, aprendo alla possibilità di eseguire fino a tre test paralleli e permettendo così di valutare differenti condizioni sullo stesso sangue. Il design del bioreattore è stato fortemente modificato per risolvere problemi legati alla facilità d'uso, alla tenuta idraulica e all'affidabilità. Parallelamente, è stato ottimizzato il metodo per studiare il processo di senescenza dei globuli rossi dopo l'incapsulamento. L'espressione di fosfatidilserina (PS) e CD47 è stata misurata attraverso test citofluorimetrici. I test biologici sono stati condotti sia con la versione precedente che con quella ottimizzata del bioreattore, per valutarne l’usabilità e l'affidabilità e confermare i miglioramenti introdotti dalla seconda. I dati ottenuti hanno permesso l’utilizzo di un modello interpretativo della quantità di Gemcitabina rilasciata dai globuli rossi durante i test. Infine, è stato svolto un confronto, in termini di capacità di incapsulamento, tra due differenti chip sviluppati al Politecnico di Milano. La parte di sviluppo tecnologico di questo lavoro è stata svolta presso il Laboratorio di Organi Artificiali (LaBS) presso il Politecnico di Milano. Mentre tutti i test biologici e le analisi citofluorimetriche sono stati condotti presso Humanitas Research Hospital. Le modifiche apportate al bioreattore e ai protocolli hanno sensibilmente migliorato l'affidabilità del sistema e la sua coerenza alle specifiche di progetto, oltre ad ottimizzare l’utilizzo di sangue riducendone lo spreco. Il nuovo bioreattore ha poi aperto la strada a possibili ulteriori sviluppi futuri, grazie alla sua praticità e scalabilità. È stato inoltre suggerito lo sviluppo e l’implementazione di un metodo passivo di ricambio del mezzo. Infine, questo nuovo standard potrebbe essere utilizzato per studiare e validare un approccio completamente nuovo, come ad esempio un sistema Tumor-on-Chip (ToC). Questo non solo ridurrebbe drasticamente la quantità di reagenti necessari, ma permetterebbe lo studio più dettagliato dei processi coinvolti e una replica più fedele dell’ambiente tumorale, introducendo, ad esempio, altri tipi cellulari.