Pilot-scale validation of a microbial platform for sustainable protein production from agricultural digestate and CO2

The growing global demand for protein and the environmental limitations of conventional livestock systems highlight the need for sustainable and circular feed and food production pathways. At the same time, the management of anaerobic digestion (AD) by-products such as digestate remains a key challenge. In this context, the valorization of agricultural digestate for single-cell protein (SCP) production offers a promising strategy to couple nutrient recovery and carbon utilization within AD systems. This thesis investigates the pilot-scale production of microbial protein from pre-treated agricultural digestate and CO2 using hydrogen-oxidizing bacteria: the mesophile Cupriavidus necator (C. necator) and the thermophile Hydrogenibacillus schlegelii (H.schlegelii). Semi-continuous autotrophic experiments were conducted in a 8-L pressurized reactor operated at 2 bar, with controlled gas supply (H2, O2, CO2), active pH regulation, and temperature set at 30°C for C. necator and at 65°C for H.schlegelii. Digestate was subjected to pilot scale pre-treatment based on polyelectolyte-driven coagulation and ultrafiltration to obtain a clarified fraction suitable for bacterial growth, and comprehensive physicochemical and microbiological analyses were conducted to ensure substrate safety and stability. Pilot-scale cultivation of C. necator demonstrated stable autotrophic growth and a marked enhancement in biomass production compared to laboratory-scale experiments. Maximum biomass concentration reached 2.1 ± 0.0 g·L-1 in AMS and 3.4 ± 0.0 g·L-1 in digestate, compared to 0.25 ± 0.02 g·L-1 and 0.97 ± 0.02 g·L-1 at laboratory scale, corresponding to an approximately sevenfold increase in AMS and a more than threefold increase in digestate. In digestate, the maximum protein concentration achieved corresponded to a protein-to-biomass ratio of 79.6 ± 0.4%. This value was consistent with laboratory-scale digestate experiments, where a protein content of 75 ± 3% was obtained, confirming preservation of biomass quality despite the substantial increase in biomass concentration. Additionally, a dynamic model was developed in OpenModelica to describe the bioprocess including microbial growth, multi-substrate limitation, gas-liquid mass transfer, and reactor pressure and pH control. The model reproduced the experimental growth trend and realistically represented reactor behaviour, particularly gas transfer and pressure dynamics. Although it underestimated the final biomass concentration, it effectively captured overall process evolution and proved suitable for system analysis and optimization.

La crescente domanda globale di proteine e le limitazioni ambientali dei sistemi zootecnici convenzionali evidenziano la necessità di percorsi produttivi sostenibili e circolari per cibo e mangimi. Allo stesso tempo, la gestione dei sottoprodotti della digestione anaerobica (AD), come il digestato, rappresenta una sfida rilevante. In questo contesto, la valorizzazione del digestato agricolo per la produzione di proteine microbiche (Single-Cell Protein, SCP) offre una strategia promettente per integrare il recupero dei nutrienti e l’utilizzo del carbonio all’interno dei sistemi AD. Questa tesi indaga la produzione su scala pilota di proteine microbiche a partire da digestato agricolo pretrattato e CO2 utilizzando batteri idrogeno-ossidanti: il mesofilo Cupriavidus necator (C. necator) e il termofilo Hydrogenibacillus schlegelii (H. schlegelii). Sono stati condotti esperimenti semi-continuui in condizioni autotrofiche in un reattore pressurizzato da 8 L operato a 2 bar, con alimentazione controllata dei gas (H2, O2, CO2), regolazione attiva del pH e temperatura impostata a 30°C per C. necator e a 65°C per H. schlegelii. Il digestato è stato sottoposto a un pretrattamento su scala pilota basato su coagulazione indotta da polielettrolita e ultrafiltrazione per ottenere una frazione chiarificata idonea alla crescita batterica, e sono state condotte approfondite analisi fisico-chimiche e microbiologiche per garantirne la sicurezza e la stabilità. La coltivazione su scala pilota di C. necator ha dimostrato una crescita autotrofa stabile e un marcato incremento della produzione di biomassa rispetto agli esperimenti su scala di laboratorio. La concentrazione massima di biomassa ha raggiunto 2,1 ± 0,0 g·L-1 in AMS e 3,4 ± 0,0 g·L-1 in digestato, rispetto a 0,25 ± 0,02 g·L-1 e 0,97 ± 0,02 g·L-1 in scala laboratorio, corrispondenti a un aumento di circa sette volte in AMS e di oltre tre volte in digestato. In digestato, la concentrazione massima di proteine ottenuta corrispondeva a un rapporto proteine/biomassa del 79,6 ± 0,4 %. Questo valore è risultato coerente con gli esperimenti in scala laboratorio su digestato, nei quali è stato ottenuto un contenuto proteico del 75 ± 3%, confermando la preservazione della qualità della biomassa nonostante il significativo aumento della concentrazione. Inoltre, è stato sviluppato un modello dinamico in OpenModelica per descrivere il bioprocesso includendo la crescita microbica, la limitazione multi-substrato, il trasferimento gas-liquido e il controllo della pressione e del pH nel reattore. Il modello ha riprodotto l’andamento sperimentale della crescita e ha rappresentato in modo realistico il comportamento del reattore, in particolare per quanto riguarda il trasferimento dei gas e le dinamiche di pressione. Sebbene abbia sottostimato la concentrazione finale di biomassa, ha descritto efficacemente l’evoluzione complessiva del processo, dimostrandosi idoneo per l’analisi e l’ottimizzazione del sistema.