Organic nanofibers for muscle cell differentiation and optostimulation

The development of functional engineered tissues requires the integration of biomimetic structural organization with minimally invasive strategies for external control of cellular activity. In skeletal muscle cell functionality, cell alignment plays a crucial role in promoting a functional and synchronized contraction. Achieving tissue-like organization together with remote and reversible control of excitability remains a major challenge in tissue engineering. In this PhD dissertation, aligned electrospun nanofibrous scaffolds were combined with membrane-targeted azobenzene photo-transducers to create optically controlled skeletal muscle constructs. Aligned and random poly(vinyl alcohol) (PVA) and poly(caprolactone) (PCL) fibers were fabricated and evaluated as substrates for myoblast differentiation and light-induced contraction. Highly aligned PVA scaffolds were selected for the fabrication of self-standing architectures, enabling quasi-three-dimensional constructs with tissue-like cellular organization supporting cell growth, differentiation, and actuation. To achieve non-genetic optical control of excitability, a new azobenzene compound (SZ) was designed. SZ was built upon two previously characterized mechanisms: opto-mechanical capacitance modulation (Ziapin2) and electro-optical surface charge redistribution (MTP2). The molecule was rationally designed to integrate both effects within a single structure, and to enable the chemical functionalization of nanofibrous substrates to fabricate an all in one platform for muscle cell differentiation and optostimulation. Such an approach may enhance the time of permanence of the azobenzenes in the plasma membrane and their orientation. Photophysical studies, molecular dynamics simulations, and electrophysiological experiments demonstrated that SZ induces robust and reversible hyperpolarization at lower concentrations than its analogues. In HEK 293 T cells and hiPSC-derived cardiomyocytes, SZ enabled reliable light-triggered modulation of membrane potential and in hiPSC action potential generation. Together, these results establish a versatile platform that combines anisotropic biofabrication and dual-mechanism molecular phototransduction for the realization of optically actuated, tissue-like constructs, advancing non-genetic strategies for the control of engineered excitable tissues.

La fabbricazione di tessuti ingegnerizzati funzionali richiede l’integrazione di un’organizzazione strutturale biomimetica, tramite l’utilizzo di strategie non invasive per il controllo esterno dell’attività cellulare. Nel muscolo scheletrico, l’allineamento delle cellule svolge un ruolo cruciale nel differenziamento, organizzazione cellulare e nel promuovere una contrazione che sia funzionale e sincronizzata. Ottenere un’organizzazione cellulare simile a quella tissutale, insieme a un controllo remoto e reversibile dell’eccitabilità, rappresenta ancora una delle principali sfide dell’ingegneria tissutale. In questa tesi di dottorato, tramite l’elctrospinning, sono stati fabbricati scaffold nanofibrosi. Questi sono stati combinati successivamente con foto-trasduttori azobenzenici in grado di penetrare all’interno della membrana cellulare in modo tale da creare tessuti di muscolo scheletrico controllabili otticamente. Fibre allineate e random di poli (vinil alcol) (PVA) e poli (caprolattone) (PCL) sono state fabbricate e valutate come substrati per la differenziazione di mioblasti e il supporto della contrazione otticamente indotta. Gli scaffold in PVA altamente allineati sono stati selezionati per la realizzazione di un’architettura self-standing in grado di generare un costrutto quasi tridimensionale con un’organizzazione cellulare simil-tissutale, supportando crescita, differenziazione e attuazione. In questa tesi è stato progettato un nuovo composto azobenzenico (SZ) per modulare otticamente le proprietà di membrana cellulare, senza la necessità di modifiche genetiche. Il design di SZ si basa su due meccanismi precedentemente caratterizzati: la modulazione opto-meccanica della capacità di membrana (Ziapin2) e la ridistribuzione elettro-ottica della carica superficiale (MTP2). SZ è stata progettata per combinare entrambi gli effetti in un’unica struttura molecolare e, in prospettiva, per consentire la funzionalizzazione chimica dei substrati nanofibrosi di PVA al fine di realizzare una piattaforma “all-in-one” per la differenziazione e l’opto-stimolazione delle cellule muscolari, superando il limite del tempo di permanenza e l’orientazione degli azobenzeni nella membrana cellulare. Studi sulla fotofisica, simulazioni di dinamica molecolare ed esperimenti di elettrofisiologia hanno dimostrato che SZ induce una robusta iperpolarizzazione e reversibile a concentrazioni inferiori rispetto ai suoi analoghi. In cellule HEK 293T e cardiomiociti derivati da hiPSC, SZ ha consentito una modulazione del potenziale di membrana indotta dalla luce e, nei cardiomiociti hiPSC, la generazione di potenziali d’azione. Nel complesso, questi risultati pongono le basi per una piattaforma che combina bio-fabbricazione e foto-trasduzione molecolare con un duplice meccanismo per la realizzazione di costrutti simil-tissutali attuabili otticamente, aprendo nuove prospettive per strategie non genetiche di controllo di tessuti ingegnerizzati eccitabili.