Microenvironmental optimization in TG-PEG hydrogels for in vitro modelling of osteochondral tissue

Osteochondral tissue engineering remains a major challenge in regenerative medicine due to the complex organization of the osteochondral interface, where cartilage and subchondral bone coexist as closely connected but highly distinct tissues. For this reason, in vitro models capable of mimicking the spatial and cellular organization of the osteochondral unit are required, both to investigate the interactions between osteogenic and chondrogenic cellular components and to support the development of regenerative strategies. In this thesis work, an in vitro model based on TG-PEG was optimized and characterized. The model was designed to generate distinct but communicating microenvironments within the same construct. First, TG-PEG hydrogels were characterized in terms of mechanical properties. Rheological analysis revealed a strong correlation between precursor concentration and hydrogel stiffness, confirming the tunability of the TG-PEG system. Osteogenic and chondrogenic studies were then conducted separately to evaluate the response of the two cellular components. For osteogenic studies, human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells, hBM-MSCs, were encapsulated in TG-PEG bulk hydrogels or seeded onto TG-PEG microgels and cultured in the presence of Bone Morphogenetic Protein 2, BMP-2. For chondrogenic studies, human nasal chondrocytes, hNCs, were encapsulated in TG-PEG bulk hydrogels or seeded onto TG-PEG microgels and cultured in the presence of Transforming Growth Factor-β3, TGF-β3. To evaluate the influence of scaffold architecture on cell behaviour, cell spreading and proliferation were assessed in both bulk hydrogels and microgels by immunofluorescence staining. In addition, osteogenic and chondrogenic differentiation were investigated by analysing the expression of key specific markers using RT-qPCR. Co-culture conditions were also optimized to identify a strategy compatible with both hBM-MSCs and hNCs. Based on the results obtained from the experiments performed separately on the two cell types and from the optimization of the culture conditions, a double model of bulk hydrogels and microgels was assembled by combining hBM-MSCs encapsulated within TG-PEG bulk hydrogels and hNCs seeded on TG-PEG microgels. This configuration allowed the formation of two spatially distinct compartments and a defined interface between the bulk and microgel phases. Overall, TG-PEG scaffolds provided a tunable 3D environment capable of supporting distinct but complementary cellular behaviours in bulk and microgel architectures. The microgel phase appeared to promote enhanced cell spreading, proliferation, and cellular connectivity, likely due to its more open and microstructured architecture. At the same time, TG-PEG bulk hydrogels supported both osteogenic and chondrogenic differentiation, as BMP-2 supplementation promoted the osteogenic response of hBM-MSCs, while TGF-β3 supplementation promoted chondrogenic matrix production by hNCs. This work provides an in vitro model for studying spatially organized co-cultures and highlights the relevance of hydrogel architecture, biochemical cues, and cell-specific microenvironments for developing more representative osteochondral models and guiding future regenerative strategies.

L’ingegneria dei tessuti osteocondrali rappresenta ancora una sfida rilevante nell’ambito della medicina rigenerativa, a causa della complessa organizzazione dell’interfaccia osteocondrale, in cui cartilagine e osso subcondrale coesistono come tessuti strettamente connessi, ma profondamente distinti. Per questo motivo, sono necessari modelli in vitro in grado di mimare l’organizzazione spaziale e cellulare dell’unità osteocondrale, sia per studiare le interazioni tra le componenti cellulari osteogeniche e condrogeniche sia per supportare lo sviluppo di strategie rigenerative. In questo lavoro di tesi è stato ottimizzato e caratterizzato un modello in vitro basato su idrogeli di TG-PEG, progettato per generare microambienti distinti ma comunicanti all’interno dello stesso costrutto. In una prima fase, gli idrogeli di TG-PEG sono stati caratterizzati in termini di proprietà meccaniche. L’analisi reologica ha evidenziato una correlazione tra la concentrazione dei precursori e la rigidezza dell’idrogel, confermando la modulabilità del sistema TG-PEG. Successivamente, sono stati condotti studi osteogenici e condrogenici separati per valutare la risposta dei due tipi cellulari. Per gli studi osteogenici, cellule stromali mesenchimali umane derivate da midollo osseo, hBM-MSCs, sono state incapsulate in idrogeli di TG-PEG oppure seminate su microgel di TG-PEG e coltivate in presenza di Bone Morphogenetic Protein 2, BMP-2. Per gli studi condrogenici, condrociti nasali umani, hNCs, sono stati incapsulati in idrogeli di TG-PEG oppure seminati su microgel di TG-PEG e coltivati in presenza di Transforming Growth Factor-β3, TGF-β3. Per valutare l’influenza dell’architettura dello scaffold sul comportamento cellulare, lo spreading e la proliferazione cellulare sono stati analizzati sia negli idrogeli bulk sia nei microgel mediante staining di immunofluorescenza. Inoltre, la differenziazione osteogenica e condrogenica è stata studiata analizzando l’espressione di marker specifici mediante RT-qPCR. Le condizioni di co-coltura sono state inoltre ottimizzate al fine di identificare una strategia compatibile sia con le hBM-MSCs sia con gli hNCs. Sulla base dei risultati ottenuti dagli esperimenti condotti separatamente sui due tipi cellulari e dall’ottimizzazione delle condizioni di coltura, è stato assemblato un modello doppio costituito da idrogeli bulk e microgel, combinando hBM-MSCs incapsulate all’interno di idrogeli bulk di TG-PEG e hNCs seminate su microgel di TG-PEG. Questa configurazione ha permesso la formazione di due compartimenti spazialmente distinti e di un’interfaccia definita tra la fase bulk e la fase microgel. Nel complesso, gli scaffold di TG-PEG hanno fornito un ambiente tridimensionale modulabile, capace di supportare comportamenti cellulari distinti ma complementari nelle architetture bulk e microgel. La fase microgel ha favorito un maggiore spreading cellulare, una maggiore proliferazione e una maggiore connettività cellulare, probabilmente grazie alla sua architettura più aperta e microstrutturata. Allo stesso tempo, gli idrogeli bulk di TG-PEG hanno supportato sia la differenziazione osteogenica sia quella condrogenica, poiché la supplementazione con BMP-2 ha promosso la risposta osteogenica delle hBM-MSCs, mentre la supplementazione con TGF-β3 ha promosso la produzione di matrice condrogenica da parte degli hNCs. Questo lavoro propone una piattaforma in vitro per lo studio di co-colture spazialmente organizzate e mette in evidenza l’importanza dell’architettura dell’idrogel, degli stimoli biochimici e dei microambienti specifici per ciascun tipo cellulare nello sviluppo di modelli osteocondrali più rappresentativi e nell’orientamento di future strategie rigenerative.