Engineering light sensitivity in Chlamydomonas reinhardtii

The work presented in this doctoral thesis uses Chlamydomonas reinhardtii as a model system to investigate how a single photosensitive cell translates light perception into a behavioural response, and how this process can be externally modulated. The thesis approaches phototaxis as a problem of sensory transduction and investigates the pathway underlying it: from photon absorption to changes in membrane potential, 𝐶𝑎2+ signalling, and the modulation of flagellar beating. In parallel, the photosynthetic apparatus is treated as a second functional layer of the same cell, accessible through chlorophyll fluorescence and fluorescence lifetime imaging. Within this framework, swimming trajectories and fluorescence are treated as two complementary observational languages for accessing the functional state of the cell. A central contribution of the thesis is the development of a generalisable quantitative method for single-cell motility analysis in active particle systems. The workflow combines automated single-particle tracking, kinematic classification, directional clustering, and mean square displacement analysis over temporal windows. It resolves coherent subpopulations that remain invisible in aggregated measurements, where individual behaviours are averaged out. Applied to heterogeneous Chlamydomonas populations, this method shows that the collective response arises from the coexistence of distinct motile states, including subgroups displaying different orientations under the same light stimulus. Building on this framework, the thesis examines the effect of Ziapin2, a non-genetic amphiphilic photoactuator, in an organism that already possesses its own photosensitive architecture. In Chlamydomonas, the data show that Ziapin2 does not behave as a functional photoswitch, as previously described in animal eukaryotic cells. Its effect on motility is rapid, reversible, and dose-dependent, yet independent of the stimulation wavelength, not mediated by the endogenous photoreceptors (ChR1 and ChR2), and results in motility arrest. At the same time, steady-state fluorescence and FLIM measurements reveal an effect consistent with selective quenching of the excited state accessible when PSII is in the closed-centre configuration, with unchanged F0 and basal lifetime and a dose-dependent reduction in F𝑚 and Δ𝜏. A coherent picture therefore emerges, in which motility arrest and quenching of the photosynthetic antenna represent two distinct phenomena, separated by functional threshold and cellular compartment. Overall, this work considers the phototactic pathway of Chlamydomonas reinhardtii as a signal transduction chain that converts light perception into an electrical and then a mechanical response, and that can be interrogated through external transducers. By applying the quantitative single-cell framework and integrating it with fluorescence readouts of the photosynthetic apparatus, the thesis shows that the effect of exogenous molecules in photosensitive biological systems is constrained by the functional architecture of the host cell. This perspective suggests that external perturbation does not merely alter cellular behaviour, but also provides a means to clarify the principles governing the coupling between light perception, photosynthetic state, and behavioural output.

Il lavoro presentato in questa tesi di dottorato utilizza Chlamydomonas reinhardtii come sistema modello per studiare come una singola cellula fotosensibile traduca la percezione della luce in una risposta motoria, e come sia possibile intervenire su questo processo per modularlo. Muovendo dalla fototassi come problema di trasduzione sensoriale, la tesi ricostruisce il circuito che collega assorbimento del fotone, variazione del potenziale di membrana, segnalazione del 𝐶𝑎2+ e modulazione del battito flagellare, e considera parallelamente l’apparato fotosintetico come secondo livello funzionale della stessa cellula, interrogabile attraverso fluorescenza della clorofilla ed il fluorescence lifetime imaging. In questa prospettiva, traiettoria di nuoto e fluorescenza vengono trattate come due linguaggi osservativi complementari per accedere allo stato funzionale della cellula. Un contributo centrale della tesi è lo sviluppo di un metodo quantitativo generalizzabile per l’analisi della motilità a singola cellula in sistemi di particelle attive. Il workflow combina tracking automatizzato, classificazione cinematica, clustering direzionale e analisi della mean square displacement in finestre temporali, consentendo di risolvere sottopopolazioni coerenti che rimangono invisibili nelle misure aggregate. Applicato a popolazioni eterogenee di Chlamydomonas, questo approccio mostra che la risposta collettiva non coincide con una semplice media dei comportamenti individuali, ma emerge dalla coesistenza di stati motori distinti, inclusi sottogruppi con orientamenti differenti rispetto allo stesso stimolo luminoso. Su questa base metodologica, la tesi esamina l’effetto di Ziapin2, un fotoattuatore anfifilico non genetico, in un organismo che possiede già una propria architettura di fotosensibilità. In Chlamydomonas, i dati mostrano che Ziapin2 non si comporta da photoswitch funzionale, come invece documentato in cellule eucariotiche animali: il suo effetto sulla motilità è rapido, reversibile e dose-dipendente, ma allo stesso tempo indipendente dalla lunghezza d’onda di stimolazione, non mediato dai fotorecettori endogeni (ChR1 e ChR2) e si manifesta con un arresto della motilità. In parallelo, le misure di fluorescenza stazionaria e FLIM rivelano un effetto compatibile con un quenching selettivo dello stato eccitato accessibile quando PSII si trova nella configurazione a centri chiusi, con F0 e lifetime basale invarianti e una riduzione dosedipendente di F𝑚 e di Δ𝜏. Ne emerge un quadro coerente in cui arresto della motilità e quenching dell’antenna fotosintetica rappresentano due fenomeni distinti, separati per soglia funzionale e compartimento cellulare. Nel complesso, questo lavoro assume il pathway fototattico di Chlamydomonas reinhardtii come una catena di trasduzione del segnale che converte la percezione della luce in una risposta elettrica e quindi meccanica, e che può essere interrogata mediante trasduttori esterni. Integrando un approccio quantitativo per l’analisi single-cell di popolazioni complesse con i readout di fluorescenza della catena fotosintetica, la tesi mostra che l’effetto di molecole esogene in sistemi biologici fotosensibili è vincolato dall’architettura funzionale della cellula ospite. Ne deriva una prospettiva in cui la perturbazione esterna non si limita a modificare il comportamento cellulare, ma diventa uno strumento per risolvere i principi che organizzano l’accoppiamento tra percezione della luce, stato fotosintetico e output motorio.