Development and validation of methods for isolating the nanoparticle-protein corona: from model nanoparticles to clinically relevant formulations

Iron deficiency anaemia is one of the most widespread health disorders worldwide and, in severe cases, may require treatment with intravenous iron-based nanoparticle formulations such as Ferinject® (FCM) and Venofer® (IS). Despite their extensive clinical use, the behavior of these nanomedicines in biological environments is still not fully understood, particularly regarding the possible formation of a protein corona on the nanoparticle (NP) surface. Understanding their biological behavior remains challenging, largely due to the difficulties associated with isolating and characterizing NP–protein corona complexes. These challenges are particularly relevant for iron-based NP systems characterized by small size, low density, and complex colloidal structure, which are often incompatible with traditional centrifugation-based isolation approaches. Since nano-bio interactions strongly influence NP stability, biodistribution, and biological fate, their investigation is essential for understanding the safety and performance of these systems. This project focused on the development and validation of a comparative methodological approach for the isolation and characterization of NP–protein corona complexes, with the aim of evaluating NP–protein affinity constants using two different isolation strategies. Conventional centrifugation and size exclusion chromatography coupled with fast protein liquid chromatography (SEC-FPLC) were systematically investigated and compared, with particular attention to SEC-FPLC as a new reliable isolation strategy for challenging NP systems. Fluorescent carboxylated polystyrene (PS) NPs and human serum albumin (HSA) were initially employed as a simplified model system for protocol optimization and validation. Both centrifugation and SEC-FPLC methods were successfully validated through quantitative characterization of NP–protein interactions. Adsorption isotherms and NP–protein affinity constants were determined from SDS-PAGE analyses, demonstrating the reliability, reproducibility, and quantitative capability of SEC-FPLC for NP–protein corona isolation and characterization. In addition, the PS NP model demonstrated the formation of a stable and reproducible protein corona, enabling quantitative investigation of adsorption mechanisms. Following validation, the optimized SEC-FPLC methodology was applied to clinically relevant iron NP formulations, with a particular focus on FCM NPs. In contrast to the model NPs commonly used in protein corona studies, the iron-based nanoformulation did not show significant protein corona formation under the adopted experimental conditions, suggesting limited interaction with plasma proteins. Overall, this work demonstrates that SEC-FPLC represents a robust and reliable alternative to conventional centrifugation for studying NP–protein interactions, particularly for nanomedicine systems not compatible with centrifugation-based isolation methods, providing new insights into the biological behavior of clinically relevant iron-based nanomedicines.

L'anemia sideropenica rappresenta uno dei disturbi della salute più diffusi a livello mondiale e, nei casi più gravi, può richiedere il trattamento mediante formulazioni a base di nanoparticelle di ferro somministrate per via endovenosa, quali Ferinject® (FCM) e Venofer® (IS). Nonostante il loro ampio utilizzo clinico, il comportamento di queste nanomedicine in ambiente biologico non è ancora completamente chiaro, in particolare per quanto riguarda la possibile formazione di una corona proteica sulla superficie della nanoparticella (NP). La comprensione di questi fenomeni risulta ancora complessa, soprattutto a causa delle difficoltà associate all'isolamento e alla caratterizzazione dei complessi NP-corona proteica. Tali criticità sono particolarmente rilevanti per queste NPs a base di ferro, le cui ridotte dimensioni, la bassa densità e la complessa struttura colloidale le rendono incompatibili con i tradizionali approcci di isolamento basati sulla centrifugazione. Poiché le interazioni nano-bio influenzano fortemente la stabilità, la biodistribuzione e il destino biologico delle NPs, il loro studio risulta fondamentale per comprendere la sicurezza e le prestazioni di questi sistemi. Il presente progetto è stato dedicato allo sviluppo e alla validazione di un approccio metodologico comparativo per l'isolamento e la caratterizzazione dei complessi NP-corona proteica, con l'obiettivo di determinare le costanti di affinità NP-proteina mediante due differenti strategie di isolamento. La centrifugazione convenzionale e la cromatografia ad esclusione dimensionale accoppiata alla cromatografia liquida rapida per proteine (SEC-FPLC) sono state studiate e confrontate in modo sistematico, con particolare attenzione alla SEC-FPLC come una nuova affidabile strategia per l'isolamento di sistemi di NPs complesse. NPs fluorescenti di polistirene carbossilato (PS) e albumina sierica umana (HSA) sono state inizialmente utilizzate come sistema modello semplificato per l'ottimizzazione e la validazione del protocollo. Entrambi i metodi, centrifugazione e SEC-FPLC, sono stati validati con successo mediante la caratterizzazione quantitativa delle interazioni NP-proteina. Le isoterme di adsorbimento e le costanti di affinità NP-proteina sono state determinate mediante analisi SDS-PAGE, dimostrando l'affidabilità, la riproducibilità e la capacità quantitativa della SEC-FPLC nell'isolamento e nella caratterizzazione dei complessi NP-corona proteica. Inoltre, il sistema modello basato sulle NPs di polistirene ha evidenziato la formazione di una corona proteica stabile e riproducibile, consentendo lo studio quantitativo dei meccanismi di adsorbimento. Successivamente, la metodologia SEC-FPLC ottimizzata è stata applicata a formulazioni a base di NPs di ferro di rilevanza clinica, con particolare attenzione alle FCM NPs. A differenza delle NPs comunemente impiegate negli studi sulla corona proteica, la nanoformulazione a base di ferro non ha mostrato una significativa formazione di corona proteica nelle condizioni sperimentali adottate, suggerendo una limitata interazione con le proteine plasmatiche. Nel complesso, questo lavoro dimostra che la SEC-FPLC rappresenta un'alternativa robusta e affidabile alla centrifugazione convenzionale per lo studio delle interazioni NP-proteina, in particolare nei sistemi nanomedicinali non compatibili con metodi di isolamento basati sulla centrifugazione, fornendo nuovi elementi per la comprensione del comportamento biologico di nanomedicine a base di ferro di rilevanza clinica.