Cell labeling optimization for quantitative 19F-MRI tracking in glioblastoma adoptive T-Cell therapy

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy is among the most promising strategies in modern cancer immunotherapy. Although CAR-T therapies have achieved remarkable clinical results in hematological malignancies, their application to solid tumors such as "glioblastoma" remains limited by multiple biological and technological challenges. A critical gap is the lack of non-invasive methods to monitor the fate of therapeutic cells after infusion, including biodistribution, persistence, and capacity for tumor infiltration. This thesis addresses this need, aiming at developing fluorinated nanoparticles for labeling CAR-T cells, enabling their potential tracking by "fluorine-19 magnetic resonance imaging" ( ¹⁹F-MRI). The approach relies on encapsulating a highly fluorinated molecular probe (PERFECTA: suPERFluorinatEd ContrasT Agent) within biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nanoparticles stabilized with surfactants, including sodium cholate (NaC). Optimized fluorinated nanoparticles, designed to efficiently label CAR-T cells while preserving viability and cytotoxic function, were physicochemically characterized and showed preserved structural integrity and fluorine content in CAR-T cell-conditioned media, despite protein corona formation. This formulation was used to label human B7-H3-directed CAR-T cells, targeting an antigen widely expressed across nearly all glioblastoma subtypes. Flow cytometry confirmed preserved CAR-T cell viability (approximately 95%) and highly efficient nanoparticle uptake across the cell population (>99% NP-positive cells). Quantitative ¹⁹F-NMR/MRI revealed a mean intracellular loading ranging from approximately 9,39 ×10¹¹ to 1,90 ×10¹³ 19F atoms per cell, markedly exceeding previously reported values for CAR-T cell labeling. This optimization enabled robust detection of labeled cells by ¹⁹F-MRI, with a signal-to-noise ratio (SNR) exceeding the detection threshold by approximately five-fold. Co-culture experiments with U-87 glioblastoma cells confirmed that nanoparticle labeling does not compromise CAR-T cytotoxic activity, with retained ability to eliminate tumor cells and a detectable ¹⁹F signal throughout the observation period. These findings indicate that fluorinated PLGA nanoparticles constitute a non-toxic, promising labeling platform for CAR-T cells and for developing quantitative cellular tracking strategies by ¹⁹F-MRI. Beyond MRI tracking, the intracellular fate of nanoparticles was investigated by Raman imaging. From a translational perspective, this approach could be extended beyond CAR-T cells to other cell-based therapies, including stem cells and mesenchymal stem cells (MSCs), providing a versatile platform for non-invasive in vivo visualization of cell distribution, persistence, and fate, supplying critical information to more effective personalized immunotherapies.

La terapia basata su cellule linfocitarie T dotate di recettore chimerico per l'antigene (CAR-T) rappresenta una delle strategie più promettenti dell'immunoterapia oncologica moderna. Sebbene le terapie CAR-T abbiano ottenuto risultati clinici straordinari nelle neoplasie ematologiche, la loro applicazione ai tumori solidi, come il "glioblastoma", è ancora limitata da numerose sfide biologiche e tecnologiche. Una delle limitazioni più critiche è la mancanza di metodi non invasivi in grado di monitorare il destino delle cellule terapeutiche dopo l'infusione, inclusi la biodistribuzione, la persistenza e la capacità di infiltrazione tumorale. Questa tesi affronta tale problematica sviluppando nanoparticelle fluorurate per la marcatura delle cellule CAR-T, consentendo il loro potenziale tracciamento mediante "risonanza magnetica al fluoro-19" ( ¹⁹F-MRI). L'approccio si basa sull'incapsulamento di una sonda molecolare altamente fluorurata (PERFECTA: suPER-FluorinatEd ContrasT Agent) all'interno di nanoparticelle biodegradabili di poli(acido lattico-co-glicolico) (PLGA), stabilizzate con tensioattivi, tra cui sodio colato (NaC). Le nanoparticelle fluorurate ottimizzate, progettate per marcare in modo efficiente le cellule CAR-T, preservandone la vitalità e la funzione citotossica, sono state caratterizzate fisico-chimicamente e hanno mantenuto integrità strutturale e contenuto di fluoro in mezzi condizionati da cellule CAR-T, nonostante la formazione della corona di proteine. Questa formulazione è stata utilizzata per marcare cellule CAR-T umane dirette contro B7-H3, un antigene ampiamente espresso in quasi tutti i sottotipi di glioblastoma. L'analisi tramite citometria a flusso ha confermato una vitalità preservata delle cellule CAR-T (circa 95%) e un uptake altamente efficiente delle nanoparticelle nell'intera popolazione cellulare (>99% di cellule NP-positive). L'analisi quantitativa tramite ¹⁹F-NMR/MRI ha evidenziato un carico intracellulare medio compreso tra circa 9,39×10¹¹ e 1,90×10¹³ atomi di ¹⁹F per cellula, superando nettamente i valori precedentemente riportati per la marcatura di cellule CAR-T. Tale ottimizzazione ha consentito un rilevamento robusto delle cellule marcate mediante ¹⁹F-MRI, con un rapporto segnale/rumore (SNR) 5 volte superiore alla soglia di rilevazione. Esperimenti di co-coltura con cellule di glioblastoma (U-87) hanno confermato che la marcatura con nanoparticelle non compromette l'attività citotossica delle cellule CAR-T, che mantengono la capacità di eliminare efficacemente le cellule tumorali e un segnale ¹⁹F-MRI persistente durante l'intero periodo di osservazione. Questi risultati dimostrano che le nanoparticelle in PLGA fluorurate rappresentano un simil-agente di contrasto non tossico e promettente per la marcatura delle cellule CAR-T e per lo sviluppo di strategie di tracciamento cellulare quantitativo mediante ¹⁹F-MRI. Oltre al tracciamento basato su MRI, è stato inoltre investigato il destino intracellulare delle nanoparticelle mediante imaging Raman. Da una prospettiva traslazionale, questo approccio potrebbe essere esteso oltre le cellule CAR-T ad altre strategie di terapia cellulare, incluse le cellule staminali e le cellule staminali mesenchimali (MSCs), fornendo una piattaforma versatile per la visualizzazione non invasiva in vivo della distribuzione, della persistenza e del destino cellulare, e fornendo informazioni cruciali per lo sviluppo di immunoterapie personalizzate più efficaci.