Development of non-viral mRNA carriers for CAR-T production in glioblastoma models

Glioblastoma (GBM) remains the most aggressive primary brain tumor in adults, characterized by a highly infiltrative growth pattern and an immunosuppressive microenvironment that render conventional therapeutic approaches largely ineffective. Despite advancements in surgical resection and adjuvant treatments, prognosis remains poor, driving the need for innovative therapeutic strategies. In this scenario, immunotherapy, particularly chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy, represents a revolutionary paradigm shift in oncology. However, successfully translating CAR-T clinical efficacy to solid tumors like GBM is still hindered by major manufacturing bottlenecks and safety concerns related to the traditional use of viral vectors for genetic modification. To overcome these limitations, non-viral transient transfection via messenger RNA (mRNA) has emerged as a safer and highly promising alternative, avoiding risks of genomic integration. Among non-viral vehicles, lipid nanoparticles (LNPs) stand out for their exceptional capacity to encapsulate, protect, and deliver nucleic acid payloads. The main objective of this thesis is to formulate, characterize and optimize an mRNA-loaded LNP platform using a reproducible formulation method to achieve efficient transient engineering in primary human T lymphocytes. Physical-chemical characterization via dynamic light scattering (DLS) confirmed the formation of monodisperse nanoformulations, displaying optimal hydrodynamic sizes and a narrow polydispersity index, suitable for further biological studies. mRNA encapsulation efficiency was quantitatively determined through RiboGreen assay, while agarose gel electrophoresis validated total nucleic acid (NA) integrity and protection within the lipid structure. Biological validation was performed sequentially, establishing robust transfection protocols first in a control cell line (HEK 293T) and consequently, translating the optimized conditions to primary human T cells. Flow cytometry analysis demonstrated that the formulated LNPs achieved high transfection efficiencies alongside satisfactory cell viability, yielding performance levels comparable to electroporation, the current clinical standard beyond viral vectors. In conclusion, this work establishes a preliminary work to produce functional and scalable non-viral LNP-based platform for primary T-cell engineering, paving the way for future translation ultimately aiming to outperform electroporation for targeted CAR-T cell therapies in glioblastoma treatment.

Il glioblastoma (GBM) rimane il tumore cerebrale primario più aggressivo negli adulti, caratterizzato da un modello di crescita altamente infiltrativo e da un microambiente immunosoppressivo che rendono gli approcci terapeutici convenzionali ampiamente inefficaci. Nonostante i progressi nella resezione chirurgica e nei trattamenti adiuvanti, la prognosi rimane infausta, spingendo la necessità di strategie terapeutiche innovative. In questo scenario, l'immunoterapia, in particolare la terapia con cellule T esprimenti un recettore antigenico chimerico (CAR-T), rappresenta un cambio di paradigma rivoluzionario in oncologia. Tuttavia, il successo della traslazione dell'efficacia clinica delle CAR-T nei tumori solidi come il GBM è ancora ostacolato da importanti colli di bottiglia nella produzione e da preoccupazioni sulla sicurezza relative all'uso tradizionale di vettori virali per la modifica genetica. Per superare queste limitazioni, la transfezione transiente non virale tramite RNA messaggero (mRNA) è emersa come un'alternativa più sicura e altamente promettente, evitando i rischi di integrazione genomica. Tra i veicoli non virali, le nanoparticelle lipidiche (LNPs) si distinguono per la loro eccezionale capacità di incapsulare, proteggere e veicolare carichi di acidi nucleici. L'obiettivo principale di questa tesi è formulare, caratterizzare e ottimizzare una piattaforma di LNPs caricate con mRNA utilizzando un metodo di formulazione riproducibile per ottenere un'efficiente ingegnerizzazione transiente nei linfociti T primari umani. La caratterizzazione chimico-fisica mediante dynamic light scattering (DLS) ha confermato la formazione di nanoformulazioni monodisperse, che mostrano dimensioni idrodinamiche ottimali e un ristretto indice di polidispersione, idonee per i successivi studi biologici. L'efficienza di incapsulamento dell'mRNA è stata determinata quantitativamente attraverso il saggio RiboGreen, mentre l'elettroforesi su gel d'agarosio ha validato l'integrità totale dell'acido nucleico (NA) e la sua protezione all'interno della struttura lipidica. La validazione biologica è stata eseguita sequenzialmente, stabilendo protocolli di transfezione robusti prima in una linea cellulare di controllo (HEK 293T) e, di conseguenza, traslando le condizioni ottimizzate alle cellule T primarie umane. L'analisi in citometria a flusso ha dimostrato che le LNPs formulate hanno raggiunto elevate efficienze di transfezione unitamente a una vitalità cellulare soddisfacente, fornendo livelli di performance paragonabili all'elettroporazione, l'attuale standard clinico al di là dei vettori virali. In conclusione, questo lavoro stabilisce un lavoro preliminare per produrre una piattaforma basata su LNPs non virale, funzionale e scalabile per l'ingegnerizzazione delle cellule T primarie, aprendo la strada a una futura traslazione che mira in ultima analisi a superare l'elettroporazione per terapie CAR-T mirate nel trattamento del glioblastoma.