Raman microspectroscopy of early osteogenic differentiation: detectability and subcellular segmentation

Long Pentraxin 3 (PTX3) has emerged as an important regulator of bone remodeling, osteoblast function, and metabolic processes, playing a crucial role in several bone pathologies, such as osteoporosis and inflammation-driven bone loss. Conventional bioanalytical assays are invasive and require exogenous labeling, precluding longitudinal studies on unperturbed living cells. To overcome these constraints, spontaneous Raman microspectroscopy is emerging as a powerful label-free and minimally invasive alternative. In this thesis, a home-built spontaneous Raman microspectroscopy setup was used to assess whether this technique can detect the subtle biochemical alterations associated with metabolic rearrangements characterizing the early stages of osteoblast differentiation. Murine pre-osteoblast models, namely fixed primary calvarial cells and living MC3T3 cells, were analyzed over a \num{7}-day osteogenic induction period. Following parameter optimization, data processing relied on a dual-level approach: a single-cell analysis based on the mean cellular spectrum, and a global spatial analysis utilizing pixel-wise $k$-means cluster analysis to focus on localized biomolecular processes not visible at the whole-cell level. Results show that spectral changes during early osteogenic differentiation are subtle. While the global spatial approach identified localized signatures of matrix mineralization at \num{7} days post-induction, significant detectable biomolecular alterations associated with lipid metabolism were not observed. In conclusion, although this work confirms the potential of spontaneous Raman microspectroscopy coupled with advanced multivariate analysis for investigating osteogenic differentiation, its current diagnostic capability is constrained by intrinsically low Raman scattering cross-sections and the biological complexity of early differentiation. Further methodological improvements are required to clarify lipid-associated metabolic changes and support future PTX3 investigations.

La Pentraxina Lunga 3 (PTX3) è emersa come un importante regolatore del rimodellamento osseo, della funzione e del metabolismo degli osteoblasti, con un ruolo cruciale in diverse patologie ossee, come l'osteoporosi e la perdita ossea indotta da processi infiammatori. I saggi bioanalitici convenzionali sono invasivi e richiedono marcatori esogeni, precludendo studi longitudinali su cellule vive e non perturbate. Per superare queste limitazioni, la microspettroscopia Raman spontanea si sta affermando come un' alternativa label-free e minimamente invasiva. In questa tesi, un setup di microspettroscopia Raman spontanea realizzato in laboratorio è stato utilizzato per valutare la capacità della tecnica di rilevare le sottili alterazioni biochimiche associate ai riarrangiamenti metabolici che caratterizzano le fasi iniziali della differenziazione osteoblastica. Modelli murini di pre-osteoblasti, nello specifico cellule calvariali primarie fissate e cellule MC3T3 vive, sono stati analizzati durante un periodo di induzione osteogenica di \num{7} giorni. A seguito dell'ottimizzazione dei parameteri, l'elaborazione dei dati si è basata su un approccio a due livelli: un'analisi a singola cellula basata sullo spettro cellulare medio, e un'analisi spaziale globale mediante clustering $k$-means a livello di singolo pixel per identificare processi biomolecolari localizzati non visibili su scala interamente cellulare. I risultati mostrano che le variazioni spettrali durante le prime fasi della differenziazione osteogenica sono sottili. Sebbene l'analisi globale abbia identificato firme spettrali localizzate compatibili con la mineralizzazione della matrice a \num{7} giorni dall'induzione, non sono state osservate alterazioni biomolecolari significative riconducibili al metabolismo lipidico. In conclusione, sebbene questo lavoro confermi il potenziale della microspettroscopia Raman spontanea, accoppiata ad analisi multivariate avanzate, per lo studio della differenziazione osteogenica, la sua attuale capacità diagnostica è limitata dalle sezioni d'urto intrinsecamente basse dello scattering Raman e dalla complessità biologica tipica della differenziazione precoce. Ulteriori miglioramenti metodologici sono necessari per chiarire le dinamiche metaboliche associate ai lipidi e supportare futuri studi sulla PTX3.