Oblique plane microscopy using dynamic remote focusing

Light-sheet microscopy has become a powerful technique for imaging biological samples across microscopic and mesoscopic scales because of its low phototoxicity, intrinsic optical sectioning, and large field of view (FoV). However, conventional light-sheet systems typically employ two orthogonally arranged objectives with limited working distances, which restricts their ability to image conventionally mounted samples. Oblique plane microscopy (OPM) overcomes this limitation by using a single objective for both illumination and detection, enabling light-sheet imaging of standard sample geometries. Since the same objective is used for both excitation and detection, the light sheet must be introduced obliquely with respect to the optical axis. Imaging this tilted plane is inherently challenging, as planes that are not coincident with the focal plane of the objective experience defocus across the field of view. Even though this approach retains all the fundamental advantages of light-sheet microscopy, the tilted remote-focusing geometry results in partial clipping of the primary objective’s aperture. This reduces the effective numerical aperture (NA) and consequently degrades spatial resolution. To address this limitation, a full-aperture oblique-plane microscope was developed using off-the-shelf optical components to preserve the full detection aperture of the imaging objective. In this thesis, a full-aperture oblique-plane microscope was implemented using dynamic remote focusing instead of the conventional relay-based remote-refocusing arrangement. This approach eliminated the tilted detection geometry by implementing dynamic remote focusing with an electrically tunable lens (ETL). The ETL is a current-controlled optical element whose optical power varies in proportion to the applied input current within its operating range. By modulating the driving current, the axial focal position can be changed electronically without any mechanical translation of the lens. This dynamic remote focusing, combined with synchronized rolling-shutter detection, enables accurate capture of the illuminated oblique plane without defocus. Following initial validation of the system, the microscope was upgraded by integrating a galvanometric mirror scanner to enable faster volumetric imaging. In addition, a wavelength-splitting module was incorporated into the detection pathway, together with an additional excitation channel, to enable dual-colour imaging. These upgrades enabled the microscope to image a wider range of biological specimens, including samples exhibiting dynamic processes. The performance of the microscope was evaluated at both low and high magnification using 20x/0.50 NA and 60x/1.10 NA objectives, respectively. The absence of tilted detection geometry allowed the objectives to be switched using the turret without requiring optical realignment, thereby enabling the same specimen to be imaged at different fields of view and spatial resolutions. The 20x configuration enabled large-field imaging of extended biological specimens, whereas the 60x configuration provided higher-resolution visualization of selected regions of interest. The versatility of the system was further demonstrated by imaging a range of prepared and living biological specimens, including rapid dynamic processes such as the beating zebrafish heart. In addition, an angular-spectrum-based simulation framework was implemented to model point-spread-function formation in the oblique imaging geometry and to provide a numerical estimate of the expected spatial resolution under the model's assumptions.

La microscopia a lama di luce è diventata una potente tecnica per l'imaging di campioni biologici su scale microscopiche e mesoscopiche grazie alla sua bassa fototossicità, al sezionamento ottico intrinseco e all'ampio campo visivo (FoV). Tuttavia, i sistemi a lama di luce convenzionali impiegano tipicamente due obiettivi disposti ortogonalmente con distanze di lavoro limitate, il che ne limita la capacità di analizzare campioni montati su supporti convenzionali. La microscopia a piano obliquo (OPM) supera questa limitazione utilizzando un singolo obiettivo sia per l'illuminazione che per la rilevazione, consentendo l'imaging a lama di luce su geometrie di campioni standard. Poiché lo stesso obiettivo viene utilizzato sia per l'eccitazione che per la rilevazione, la lama di luce deve essere introdotta obliquamente rispetto all'asse ottico. L'imaging di questo piano inclinato è intrinsecamente complesso, poiché i piani che non coincidono con il piano focale dell'obiettivo subiscono una sfocatura lungo tutto il campo visivo. Sebbene questo approccio mantenga tutti i vantaggi fondamentali della microscopia a lama di luce, la geometria inclinata del fuoco remoto comporta un mascheramento parziale (clipping) dell'apertura dell'obiettivo primario. Ciò riduce l'apertura numerica (NA) effettiva e, di conseguenza, degrada la risoluzione spaziale. Per ovviare a questo limite, è stato sviluppato un microscopio a piano obliquo a piena apertura utilizzando componenti ottici commerciali per preservare l'intera apertura di rilevazione dell'obiettivo di imaging. In questa tesi, è stato implementato un microscopio a piano obliquo a piena apertura utilizzando la messa a fuoco remota dinamica al posto del convenzionale sistema di rifocheggiamento remoto basato su relè. Questo approccio ha eliminato la geometria di rilevazione inclinata implementando la messa a fuoco remota dinamica con una lente a focale variabile elettricamente (ETL). L'ETL è un elemento ottico controllato da corrente la cui potenza ottica varia in modo proporzionale alla corrente di ingresso applicata all'interno del suo intervallo operativo. Modulando la corrente di pilotaggio, la posizione focale assiale può essere modificata elettronicamente senza alcuna traslazione meccanica della lente. Questa messa a fuoco remota dinamica, combinata con una rilevazione sincronizzata a otturatore scorrevole (rolling-shutter), consente di catturare con precisione il piano obliquo illuminato senza sfocature. A seguito della convalida iniziale del sistema, il microscopio è stato aggiornato integrando uno scanner a specchio galvanometrico per consentire un imaging volumetrico più rapido. Inoltre, nel percorso di rilevazione è stato incorporato un modulo di separazione della lunghezza d'onda, insieme a un canale di eccitazione aggiuntivo, per consentire l'imaging a due colori. Questi aggiornamenti hanno permesso al microscopio di analizzare una gamma più ampia di campioni biologici, compresi quelli soggetti a processi dinamici. Le prestazioni del microscopio sono state valutate sia a basso che ad alto ingrandimento utilizzando rispettivamente obiettivi 20x/0,50 NA e 60x/1,10 NA. L'assenza di una geometria di rilevazione inclinata ha consentito di scambiare gli obiettivi utilizzando la torretta senza richiedere un riallineamento ottico, consentendo così di analizzare lo stesso campione a diversi campi visivi e risoluzioni spaziali. La configurazione 20x ha consentito l'imaging su ampio campo di campioni biologici estesi, mentre la configurazione 60x ha fornito una visualizzazione a più alta risoluzione di regioni di interesse selezionate. La versatilità del sistema è stata ulteriormente dimostrata analizzando una serie di campioni biologici preparati e viventi, compresi processi dinamici rapidi come il battito del cuore del pesce rosso (zebrafish). Inoltre, è stato implementato un modello di simulazione basato sullo spettro angolare per modellare la formazione della funzione di punto diffuso (PSF) nella geometria di imaging obliqua e per fornire una stima numerica della risoluzione spaziale attesa secondo le ipotesi del modello.