Functional and structural study of yeast 80S ribosomes

Single-particle reconstruction from cryogenic electron microscopy (cryo-EM) images is a structural technique that allows to get a three-dimensional (3D) map of large macromolecular complexes (e.g. viruses, spliceosomes, ribosomes, etc.). The quality of the biological specimen is a crucial prerequisite to obtain a reliable reconstruction. This work consists of two parts: a purification protocol of ribosomal subunits and an analysis of the sample quality by several biochemical methods. The two main aims were achieved to upscale the ribosomal purification procedure from semi-preparative to preparative scale and to optimize a new non-radioactive method (luciferase assay) as a functional test for newly purified ribosomes. Furthermore, the cryo-EM reconstruction of the ribosomal complex of the yeast 80S with Gcn1/Gcn20 proteins is presented.

La ricostruzione single-particle a partire da immagini di crio - microscopia elettronica (crio-EM) è una tecnica strutturale che permette di ottenere una mappa tridimensionale (3D) di complessi macromolecolari, quali virus, spliceosomi, ribosomi. La qualità del sample biologico è un requisito fondamentale per l'ottenimento di una ricostruzione attendibile. Questo lavoro consta di due parti: un protocollo di purificazione delle unità ribosomiali e un'analisi della qualità del sample per mezzo di diverse tecniche biochimiche. I due principali obiettivi sono stati raggiunti per portare il protocollo di purificazione dei ribosomi da una scala semi-preparativa a preparativa e per introdurre un nuovo metodo non radioattivo (luciferase assay) come test funzionale dei ribosomi purificati. Verrà inoltre presentata la ricostruzione crio-EM di un complesso ribosomiale costituito dalle proteine Gcn1/Gcn20 legate alla superficie di un ribosoma di lievito.