Studio della formazione di poliplessi per gene delivery mediante spettroscopia di fluorescenza risolta nel tempo

Gene delivery is the process in which artificial DNA sequences are introduced inside the nucleus of a cell. The possibility to transfer “therapeutic” DNA sequences into a cell currently allows the treatment of different kinds of human diseases. The transfer of nucleotide chains, or transfection, must be realized by a specially designed carrier, or gene carrier, able to protect the DNA and transport it inside the cell. The processes involved in transfection are complex and poorly understood. The current biological research efforts are directed at discovering the mechanisms involved in effective delivery of gene carriers. However, the main obstacle in the investigation of transfection processes and in the search for efficient carriers, is the lack of experimental techniques applied to gene delivery. The thesis presents how a time resolved fluorescence technique can provide useful information to the study of polymeric carriers for gene transport. Cationic polymers are arranged around the DNA and condense it into a structure more easily assimilated by the cell. Experimental measurements study the changes in fluorescence decay of Sybr Green I, a fluorescent marker of DNA widely used in specialized areas. In particular, fluorescence lifetime modifications correspond to a different structure of the polymer around the DNA. From the analysis of the measurements carried out it was observed that the inclusion of polymer in solution induces the phenomenon of fluorescence quenching. The value of fluorescence lifetime varies depending on the type of polymer, the concentration of this and the buffer solution in which the polyplex is prepared. Fluorescence lifetime can provide useful information to understand the structure of a polyplex and thus can help develop polyplexes with a higher transfection efficiency.

La gene delivery è un procedimento nel quale si introducono artificialmente sequenze di DNA all’interno del nucleo di una cellula. La possibilità di trasferire in una cellula sequenze di DNA “terapeutiche” consente attualmente di curare diverse tipologie di malattie umane. Il trasferimento delle catene nucleotidiche, o trasfezione, deve essere mediato da un vettore appositamente realizzato, chiamato vettore genico, che riesca a proteggere il DNA e trasportarlo fino all’interno della cellula. Il processo che comporta la trasfezione è complesso e poco chiaro. Gli sforzi dell’attuale ricerca biologica sono diretti a scoprire i meccanismi che comportano l’efficace somministrazione dei vettori genici. Tuttavia il principale ostacolo nella indagine dei processi di trasfezione e di ricerca di efficienti vettori per il rilascio di geni, è la mancanza di tecniche sperimentali applicate alla gene delivery. Il lavoro di tesi presenta come la tecnica di fluorescenza risolta nel tempo può fornire informazioni utili allo studio di vettori polimerici per il trasporto di geni. I polimeri cationici si dispongono attorno al DNA e lo condensano in una struttura più facilmente assimilabile dalla cellula. Nelle misure realizzate si studiano le variazioni di decadimento di fluorescenza del Sybr Green I, marcatore fluorescente del DNA ampiamente diffuso negli ambienti specializzati. In particolare le modifiche del tempo di vita di fluorescenza corrispondono ad una diversa struttura del polimero attorno al DNA. Dall’analisi delle misure effettuate è stato osservato che l’inserimento di polimero in soluzione induce il fenomeno di quenching di fluorescenza. Il valore del tempo di vita varia a seconda del tipo di polimero, della concentrazione di questo e della soluzione tampone nel quale è preparato il poliplesso. Di conseguenza una misura di fluorescenza risolta nel tempo può fornire informazioni utili per la comprensione della struttura di un poliplesso e quindi può aiutare a progettare vettori polimerici per gene delivery.