Analisi comparativa di polimeri cationici commerciali per il gene delivery e ottimizzazione dei parametri di trasfezione

The aim of gene therapy is to prevent or treat genetic, degenerative and infective diseases through the insertion of external genetic material within cells of a living organism. In the last years gene therapy has become the object of intense study that led to its wide application in clinical trials and in biological and biomedical research. This therapy modifies the protein expression of mutated cells generally by introducing DNA within the chromosomal genetic code, thereby re-establishing the correct gene expression. The improvement of gene therapy applications requires in vitro and in vivo studies on either gene vectors and therapeutic genes. Studies on vectors focus on optimizing gene transfer and expression by using a Reporter sequence, that allows focusing on the modification and the development of novel molecules. Studies on therapeutic gene’s efficacy investigate about gene ability to re-establish the right protein expression through very effective commercial vectors. Given that spontaneous entry of naked nucleic acids within cells is limited by their negative charge at physiological pH, it is necessary to develop a gene delivery system that allows masking the DNA charge and its condensation, in order to increase its affinity towards the cell membrane and induce endocytosis. Gene delivery systems can be classified into two families: viral vectors and non-viral vectors. The former class has been engineered by replacing viral genes necessary for the replication with the therapeutic ones. These vectors are reported to be very effective but they have some critical disadvantages, such as the limited extent of the genetic material they can carry, a rather high immunogenicity and mutagenesis, that can strongly limit their clinical application. Non-viral delivery vectors have gained increasing attention in the last two decades because of the high standards in terms of safety, versatility and easiness of use, allowing to overcome the limits of viral vectors. Polymers and lipids for gene delivery are cationic at physiological pH, thereby showing a high affinity towards nucleic acids. Lipid vectors are composed by one (or more) hydrophobic chain connected by a linker to one or more positively charged head-groups enabling the interaction with nucleic acids to form lipoplexes. Polymeric vectors are available at different molecular weight, and have positively charged groups at physiological pH allowing spontaneous DNA condensation in polyplexes. Main characteristics of these vectors are their chemical and structural versatility, allowing for modulation of nucleic acid complexation and transfection behavior. Linear and branched poly(ethylenimine) (lPEI and bPEI), poly(amidoamine) (PAMAM), and poly(L-lysine), are common examples of cationic polymers used for gene delivery. With the aim of providing a comparative evaluation of four among most commonly used commercially available cationic polymers (lPEI and bPEI, PAMAM, and PLL) we identified optimized conditions of transfection for lPEI 25 kDa, bPEI 50-100 kDa, PAMAM g7 100-120 kDa and PLL 15-30 kDa. It is a common observation that many factors can influence the performance of a non-viral vector, as the N/P ratio, the complexation buffer, the dose of complexes delivered to cells and the presence of serum in the culture medium. N/P ratio is defined as the ratio between the positive charges borne by the vectors and the negative charges of the DNA molecule in solution during complexation. This parameter is known to strongly influence both the efficiency and cytotoxicity of vectors. Indeed it is believed that the higher the N/P, the greater the cytotoxicity of polyplexes. Hence we performed transfection experiments with all polymers of interest evaluating the overall transfection behavior as a function of the N/P ratio, in order to identify the best compromise between transfection efficiency and cytotoxicity. Since the complexation buffer is a factor strongly influencing the shape, dimension and surface charge of polyplexes, we therefore tested the effect of Hepes and DMEM on transfection of all polymers on HeLa cells. Vectors were incubated with pGL3 plasmid, which encodes for modified firefly luciferase. This enzyme catalyzes the oxidation of a specific substrate emitting bioluminescence. The light intensity is proportional to the protein activity and hence to the transfection efficiency. Instead, Alamar Blue test, which is based on a redox indicator that fluoresces with intensity proportional to cell metabolism, namely to the sample viability, was used for evaluating the cytotoxicity. According to previous reports, we showed that the complexation buffer with high ionic strength in general, and 150 mM NaCl in particular, enhanced the transfection efficiency of lPEI/DNA complexes, while all the other polymers showed an opposite behavior; indeed they were more effective in 10 mM Hepes than in physiological saline. Moreover, lPEI 25 kDa at N/P 40 and complexed in 150 mM NaCl was the most effective among polymers because showed the highest transfection efficiency, and low cytotoxicity. bPEI 50-100 kDa at N/P 30, PAMAM g7 100-120 kDa at N/P 3 and PLL 15-30 kDa at N/P 3, each complexed in 10 mM Hepes are instead the optimal transfection conditions. These complexation conditions have been used to measure the dimension and the overall surface charge of polymer/DNA complexes by means of DLS (Dynamic Light Scattering) and microelectrophoresis techniques. These biophysical characterizations were carried out diluting the polyplex solution in serum-free DMEM. All polyplexes showed a hydrodynamic diameter of ca. 500 nm except for bPEI, that was five times smaller. The ζ potential of bPEI, PAMAM and PLL based complexes was positive, while lPEI polyplexes showed a negative surface charge. Transfection experiments were carried out with polyplexes complexed at the optimal N/P in the most effective buffer condition, varying the following transfection and cell culture conditions: the cell density; the volume of medium; and the dose of polyplexes delivered to cells. Without exception we observed that the increase of cell density and the volume of cell culture medium had no effect on transfection efficiency, while the cytotoxicity decreased. The increase of the polyplex dose led to an increased cytotoxic effect. Taken together, we identified optimal transfection conditions that were unique to each polymer. Finally we assessed the kinetic of transgene expression for each polymer in experiments that lasted 5 days. Results showed that cytotoxicity was low for all time points, and the peak of gene expression was polymer-specific. It is worth noting that PLL and bPEI showed a maximum expression level in the first 6-12 hours, while lPEI and PAMAM required longer time to attain the respective maxima (24 hours). Transfection and cell culture parameters and the conditions analyzed in this study have to be considered as a first step. Further analysis of other parameters and conditions, on other class of non-viral vectors, are needed to clarify which are the factors influencing transfectants performance. The development of mathematical models is required to predict the biological effect of cell-culture and transfection parameters.

L’obiettivo della terapia genica è quello di prevenire o curare patologie genetiche, degenerative e infettive, tramite l’inserimento di materiale genetico esogeno nelle cellule di un essere vivente. Negli ultimi anni gli studi nell’ambito della terapia genica si sono intensificati, non solo a causa dell’interesse in ambito clinico, ma anche nell’ambito della ricerca biomedica e biologica. La procedura va ad agire sull’espressione genica delle cellule con funzioni compromesse, introducendo materiale genetico, generalmente DNA, che pùò incorporarsi nel codice genetico cromosomale, ripristinando la corretta espressione proteica. L’estensione e il miglioramento dell’efficacia delle applicazioni della terapia genica sono strettamente legati a studi preliminari in vitro e in vivo, condotti sui vettori genici e sui geni terapeutici. In particolare, le ricerche sui vettori si concentrano sull’ottimizzazione del trasporto e dell’espressione del gene, che generalmente è una sequenza Reporter, principalmente tramite modifiche o co-utilizzo di trasfettanti già in commercio o sviluppo di nuove molecole. Gli studi sull’efficacia dei geni terapeutici valutano la capacità di questi ultimi di ripristinare la corretta espressione proteica, utilizzando vettori commerciali performanti. Il DNA da solo non è in grado di penetrare efficacemente nella cellula attraverso la membrana citoplasmatica, principalmente a causa della carica superficiale che la molecola espone. Inoltre il DNA, una volta entrato nella cellula, risulta instabile in quanto può essere degradato dalle nucleasi nel citoplasma. E’ quindi necessario ricorrere a dei vettori che consentano il mascheramento delle cariche negative e la condensazione del DNA, in modo da aumentarne l’affinità con la membrana cellulare e agevolarne l’endocitosi. I vettori genici possono essere di tipo virale e non virale; quelli di tipo virale sono virus ingegnerizzati che hanno la capacità di veicolare materiale genetico nella cellula ospite. L’efficacia della terapia genica virale è elevata, ma la quantità dei geni trasferiti risulta limitata. Inoltre questa tecnica presenta rischi in termini di mutagenicità e sicurezza. La terapia genica non virale nasce dall’esigenza di trovare un’alternativa per superare i limiti dell’applicazione dei vettori virali. Essa prevede l’utilizzo di molecole come lipidi e polimeri che sono cationici a pH fisiologico e che possiedono un’elevata affinità con gli acidi nucleici. Questi vettori sono oggetto di attenzione sempre maggiore per le loro caratteristiche di versatilità, facile reperibilità, impiego, e sicurezza. I vettori lipidici sono costituiti da molecole contenenti una o più teste polari cariche positivamente, unite tramite un linker a una o più code apolari idrofobiche. L’efficacia di questi vettori nel condensare spontaneamente il DNA deriva dall’interazione elettrostatica tra le teste polari del lipide e i fosfati carichi negativamente dell’acido nucleico. I complessi lipide-DNA risultanti sono chiamati lipoplessi. I vettori polimerici hanno un peso molecolare variabile e ammine protonabili a pH fisiologico, ed è proprio questa caratteristica a permettere una spontanea condensazione del DNA in complessi definiti poliplessi. La loro versatilità strutturale e chimica permette, tramite differenti reazioni di sintesi o funzionalizzazione, di modulare la capacità del vettore di complessare il DNA e di trasfettare. Alcuni polimeri policationici ampiamente utilizzati come gene delivery system sono: la polietilenimmina (lPEI) lineare (ExGen500®) e ramificata (bPEI); la poli(L-lisina) (PLL); la poliammidoammina (PAMAM) (Superfect®) e gli oligopeptidi. In questo panorama s’inserisce il presente lavoro volto ad effettuare un’analisi comparativa dei polimeri commerciali maggiormente utilizzati in gene delivery (lPEI e bPEI, PAMAM e PLL) al fine di individuare delle condizioni ottimali di trasfezione tramite la variazione di alcuni parametri di coltura cellulare e propri del vettore, al fine di ottenere prestazioni superiori in termini di elevata efficacia e bassa citotossicità. In particolare sono stati scelti i polimeri con i seguenti pesi molecolari: lPEI 25 kDa, bPEI 50-100 kDa, PAMAM di 7a generazione (g7) 100-120 kDa, e PLL 15-30 kDa. Sono numerosi i fattori da cui dipende la performance di un vettore non virale; i più importanti sono il rapporto N/P, il buffer di complessazione, la dose somministrata alle cellule, e la presenza o assenza di siero nel terreno di coltura. Il rapporto N/P è il rapporto tra la concentrazione di ammine protonabili del polimero e la concentrazione delle cariche negative del DNA in fase di complessazione. Questo parametro è fondamentale, in quanto influenza sia la citotossicità che l’efficienza del trasfettante. Infatti, all’aumentare del rapporto N/P aumenta la quantità di polimero complessato con il DNA e quindi l’effetto citotossico di un trasfettante. Per questo motivo inizialmente è stato eseguito, su tutti i polimeri considerati, un esperimento di trasfezione al variare del rapporto N/P al fine di individuare la condizione ottimale che garantisca la miglior efficienza di trasfezione e la minor citotossicità per tutti i polimeri considerati. Anche il buffer di complessazione influenza fortemente la trasfezione, determinando la forma, la dimensione, e la carica superficiale dei complessi. Sono stati quindi eseguiti esperimenti di trasfezione al variare del buffer di complessazione sui polimeri oggetto del presente studio. La sperimentazione è stata condotta su cellule di linea HeLa e il materiale genetico utilizzato è il plasmide pGL3, Luciferase Reporter Vector, che contiene una regione che codifica per la Modified Firefly Luciferase, proteina che catalizza l’ossidazione di un substrato specifico con la produzione di luce. Vi è una proporzionalità diretta tra intensità di luminescenza prodotta da un campione di lisato e la quantità di proteina prodotta, ovvero il livello di espressione del transgene. Tramite il saggio di vitalità AlamarBlue è stato valutato il grado di citotossicità dei diversi trasfettanti. Il test si basa sull’utilizzo di un indicatore redox che cambia colore in risposta alla riduzione chimica indotta dal metabolismo cellulare. In particolare è stato osservato che per lPEI vi è un aumento di efficienza di trasfezione utilizzando un buffer di complessazione ad elevata forza ionica, come NaCl 150 mM e PBS (Phosphate Buffered Saline). Per gli altri polimeri considerati, questo fenomeno è stato osservato utilizzando tamponi a bassa forza ionica, come Hepes 10 mM. Alla luce dei risultati ottenuti dagli esperimenti di trasfezione sui diversi polimeri al variare del rapporto N/P e del buffer di complessazione è stato osservato che lPEI 25kDa in NaCl 150 mM a N/P 40 consente di ottenere efficienze di trasfezione più elevate rispetto a tutti gli altri trasfettanti, pur mantenendo una bassa citotossicità. Per quanto riguarda gli altri polimeri, bPEI 50-100 kDa a N/P 30 complessato in Hepes 10 mM, PAMAM g7 a N/P 3 in Hepes 10 mM, e PLL 15-30 kDa a N/P 3 in Hepes 10 mM sono le condizioni risultate ottimali in trasfezione, e in tali condizioni sono state stimate dimensione e carica superficiale dei rispettivi poliplessi tramite la tecnica del DLS (Dynamic Light Scattering) e della microelettroforesi. La caratterizzazione chimico-fisica dei poliplessi è stata effettuata diluendo la soluzione contenente i poliplessi in DMEM (privo di siero bovino). Tutti i complessi presentano un diametro medio intorno ai 500 nm eccetto la bPEI che presenta un diametro idrodinamico di circa 100 nm. Il potenziale ζ è risultato positivo per tutti i poliplessi eccetto la lPEI che presenta una carica superficiale negativa. Alle condizioni ottimali in termini di buffer di complessazione e N/P sono stati eseguiti esperimenti di trasfezione variando uno alla volta i seguenti parametri: densità cellulare; volume di mezzo di coltura in cui sono stati diluiti i poliplessi prima di somministrarli e dose di poliplessi somministrata alle cellule. E’ stato osservato che un aumento di densità cellulare e del volume del terreno di coltura conduce a una diminuzione di citotossicità dei quattro trasfettanti senza influenzare l’efficienza di trasfezione. L’incremento della dose di poliplessi che viene somministrata alle cellule determina in tutti i polimeri un aumento dell’effetto citotossico del trasfettante, e l’identificazione di una concentrazione ottimale di utilizzo per ogni polimero. Infine è stata valutata la cinetica di espressione di tutti i poliplessi su 5 giorni. I risultati hanno mostrato che la citotossicità rimane accettabile in tutto l’intervallo temporale considerato, e il picco di espressione genica è dipendente dal polimero. In particolare PLL e bPEI presentano un livello massimo di espressione del transgene nelle prime 6-12 ore, mentre lPEI e PAMAM necessitano di tempi più lunghi (24 ore) per ottenere la loro massima efficacia. In conclusione lPEI è risultato essere il miglior agente trasfettante tra i quattro polimeri analizzati, ed è possibile ottenere performance migliori utilizzando dosi di poliplessi intermedie (0,32 μg/cm2) per le PEI, e dosi elevate (2,56 μg/cm2) per la PAMAM. Le densità cellulari e i volumi di terreno di coltura non influenzano le performance dei trasfettanti studiati. La PLL non ha mostrato significative variazioni di efficacia al variare dei parametri analizzati. Lo studio dei parametri di trasfezione e delle condizioni qui analizzate sull’efficienza di trasfezione dei poliplessi oggetto di studio costituiscono solo uno screening iniziale: sarebbe necessario studiare l’influenza di altri parametri di trasfezione e coltura cellulare (come la concentrazione di DNA, la temperatura alla quale avviene la complessazione, o l’effetto dell’assenza di siero nel terreno di coltura) e l’estensione ad altre classi di vettori non virali, per avere una visione più ampia dei fattori che governano l’efficienza di trasfezione e l’effetto citotossico di un trasfettante. Potrebbe inoltre rivelarsi utile sviluppare modelli matematici che mettano in relazione la risposta biologica con le variabili prese in considerazione.