Regulating chemical, physical, mechanical cues in the cellular microenvironment using microengineering technology

The cellular microenvironment provides cells with physical architecture, soluble and adhesive signals, growth factors, nutrients, inhibitor chemicals, and cell-cell interactions. The in vivo cellular microenvironment is composed of an intricate mixture of extracellular matrix proteins, proteoglycans, mineralized tissue and various adjacent cell types, which vary in space and time due to material deformation, chemical reactions, or cell proliferation, migration, differentiation or death (Gerecht, Burdick et al. 2007; Chung, Sudo et al. 2009; Califano and Reinhart-King 2010). Cells continually sense these inputs, process the information through signal transduction and genetic regulation, and execute a behavior. Therefore, to study cells under well-controlled and physiologically relevant conditions in vitro or to manipulate cells for clinical applications, it is important to recreate the physiological characteristics of the tissue. The use of microfluidics makes intuitive sense for engineering the cellular microenvironment. The vascular network, pulmonary system and other tissues and organs of animals and humans reveals a wealth of microfluidic structures. The structure is different from the architecture of the typical cell culture dish and there are differences in the chemical and mechanical environment cells will experience in a microfluidic environment. The aim of this research was the development of various microfluidic platforms and techniques to control the cellular microenvironment. Each topic is written as standalone story so as to allow the reader to concentrate on a particular platform/method used to control a specific aspect of the cellular microenvironment. The state of the art and previous efforts regarding aspects of the work have been introduced. Two new methods to create gradient biomaterials and control the interaction of cells with hydrogels based on the merger of materials science and microengineering have been described. 3D cell cultures as robust alternatives to traditional 2D cell culture substrates have been introduced showing a convenient, fast, and low-cost method for fabricating microwells for cell culture applications by laser ablation of a polyester film coated with silicone glue. Subsequently a simple, rapid and cost effective method of embedding a conductive and flexible material within microfluidic devices as a means to realize uniform electric fields within cellular microenvironments has been described. Finally, improved methods of sealing substrates to micro devices have been defined. In particular, a reliable, flexible and cost effective approach to fabricate devices that reversibly adhere to a substrate by taking advantage of magnetic forces has been described and characterized. In addition, the use of the technique has been outlined to demonstrate the ability of long-term culturing of primary neuronal cells in a reversible bonded microfluidic device that will be fundamental for neuropharmacological studies. Lastly, a recapitulation and future directions have been provided.

Il microambiente cellulare fornisce alle cellule architettura fisica, segnali solubili e di adesione, fattori di crescita, nutrienti, inibitori chimici ed interazioni cellula-cellula. Il microambiente cellulare in vivo è composto da un intricato miscuglio di proteine della matrice extracellulare, proteoglicani, tessuto mineralizzato e vari tipi cellulari adiacenti, che differiscono nello spazio e nel tempo per la deformazione del materiale, reazioni chimiche, o proliferazione, migrazione, differenziamento o morte cellulare (Gerecht, Burdick et al. 2007; Chung, Sudo et al. 2009; Califano and Reinhart-King 2010). Le cellule avvertono continuamente questi input, processano l’informazione attraverso trasduzione del segnale e regolazione genetica ed eseguono un’attività. Per questi motivi per studiare in vitro cellule sotto condizioni ben controllate e rilevanti fisiologicamente o per manipolare cellule per applicazioni cliniche è importante ricreare le caratteristiche fisiologiche del tessuto. L’impiego della microfluidica è intuitivamente sensato per l’ingegnerizzazione del microambiente cellulare. La rete vascolare, il sistema polmonare ed altri tessuti ed organi animali e umani sono ricchi di strutture microfluidiche. La struttura è differente dall’architettura delle tipiche piastre di coltura e ci sono differenze nell’ambiente chimico e meccanico quando le cellule si trovano in un ambiente microfluidico. L’obiettivo di questa ricerca è stato lo sviluppo di diverse piattaforme microfluidiche e tecnologie per controllare il microambiente cellulare. Ogni argomento è stato scritto come una storia a sé stante in maniera tale che il lettore possa meglio concentrarsi su un particolare strumento e/o approccio utilizzato per controllare uno specifico aspetto del microambiente cellulare. É stata effettuata una panoramica dello stato dell’arte e sono stati introdotti gli studi compiuti sinora. Si sono descritti due nuovi metodi per creare gradienti di biomateriali e controllare l’interazione di cellule con idrogeli sulla base delle scienze dei materiali e della microingegneria. Sono state introdotte le colture cellulari 3D come robuste alternative alle tradizionali colture su substrati 2D mostrando, in particolare, un metodo conveniente, veloce e a basso costo per fabbricare micropozzetti per applicazioni di coltura cellulare mediante ablazione laser di un strato di poliestere ricoperto con colla siliconica. È stato inserita successivamente la descrizione di un metodo semplice, rapido e a basso costo per integrare un materiale conduttivo e flessibile all’interno di dispositivi microfluidici per la realizzazione di campi elettrici uniformi in microambienti cellulari. Sono stati infine descritti metodi per sigillare substrati a micro dispositivi. In particolare è stato descritto un approccio affidabile, flessibile ed a basso costo per fabbricare dispositivi che aderiscano in maniera reversible ad un substrato sfruttanndo forze magnetiche. In aggiunta è stato descritto l’impiego della precedente tecnica per dimostrare l’abilità di coltivare a lungo termine cellule neuronali primarie in un dispositivo microfluidico sigillato reversibilmente che sarà fondamentale per studi neurofarmacologici. Per concludere è stata fornita una ricapitolazione e gli sviluppi futuri del lavoro.