Valutazione e ottimizzazione di sequenze MRI per la rilevazione di marker molecolari fluorurati : simulazioni e prove sperimentali

Introduction:Aim of this thesis is to accomplish a preliminary evaluation of MRI Gradient Echo (GRE) sequences compared to multiple echo fast spin echo, using 19F Magnetic Resonance Imaging in a high field scanner (7T, Bruker) on phantoms containing pure Trifluorotoluene (TFT) and diluted Fludeoxyglucose (FDG). Sensitivity in terms of Signal to Noise Ratio (SNR) is evaluated both through numerical simulations and experimental scans considering optimal sequence settings. 19F MRI is a low sensitivity method due to the intrinsic low magnetization and the low concentration of fluorine nuclei (millimolar range), that it is necessary to employ in biological applications. Hence, the interest of improving SNR given concentration and time acquisitionconstraints for in-vivo molecular imaging. This is a pilot study forwarding a cooperation with the Istituto Neurologico Carlo Besta for fluorine-MRI applications in pre-clinical neurological studies. State of art: Today’s diagnostic imaging techniques are found on betraying alterations on anatomy and morphology at microscopic level, sometimes overlapping functional information, in order to characterize a disease. Molecular imaging is a multidisciplinary field, that merges together many areas such as cellular biology, molecular biology, chemistry, medicine and pharmacology and takes a central place in the functional and metabolic imaging paradigm. Molecular imaging allows early detection of changes related to a pathology on a molecular level, using disease-specific probes. In the last few decades, 19F MRI has gathered growing importance in in-vivo biomolecular and cell-tracking studies, thanks to desirable instances, such as 100% abundance of 19F isotope in nature, nucleus stability, and almost absent background in biological tissues. Furthermore, 19F nucleus has many comparable physical properties with 1H nucleus, as its high relative sensitivity (0.83) and a resonance frequency close to proton (at 7T, 280.35 MHz for 19F vs 298.032 for 1H). For these reasons, 19F MRI can produce an image quality similar to 1H MRI and a potentially high contrast to noise ratio , if a fluorinated compound can be used as contrast agent. On the contrary, the low sensitivity of MRI in general, the potential toxicity and the insolubility in water could generate some issues in the preparation and in the imaging of these molecular probes. 19F MRI applications include, for example, the investigation of drugs, the studies of inflammation processes and the stem-cells migration analysis. A large number of studies has demonstrated that 19F MRI sensitivity is limited to millimolar concentration, so that MR is less sensitive than medicine techniques for in vivo applications. For this reason increasing sensitivity is the main goal for the development of 19F MRI. In this thesis we focused on two sort of sequence: Fast Spin Echo (Rapid acquisition with Relaxation Enhancement, RARE) and GRE. Spin Echo is the basic MRI pulse sequence using a 90°excitation and a 180°refocusing pulse in order to obtain a signal echo, responsible of image formation. An commonly used sequence which includes multiple 180°refocusing pulse is named RARE. This fast technique allows the reduction of acquisition time simply increasing the echoes collected number (Echo Train Length or RARE factor, RF). GRE is a type of MR signal creating by the application of a gradient reversal. Unlike the Spin Echo is governed by the absence of a 180°refocusing pulse, leading shorter repetition time (TR) and faster sequences. A major difference between Spin Echo and GRE is also related to the relaxation time that characterized the echo decay: T2 for Spin Echo and T 2* for GRE. Because of the use of a short TR, longitudinal magnetization does not recover completely; nonetheless, a steady state is reached by keeping low flip angles. Spoil gradients allow the active destruction of residual transverse magnetization at the end of a TR and the achievement of a steady state condition for the transverse magnetization. Materials and Methods: The experimental samples were based on phantom containing 10ml of pure TFT and 50 mM of diluted FDG in a water solution. Images were acquired on a Biospec 70/30 USR magnetic resonance imaging scanner (Bruker, Ettlingen, Germany). This system has a magnetic field of 7T and 30cm of bore diameter. It was provided of an actively shielded 206mm gradient set (BGA-12-S), with a maximum gradient amplitude of 400mT/m, and a volume RF coil, tunable to 1H and 19F resonance frequencies (300MHz and 282MHz, respectively). Theoretical signal and SNR were computed through numerical simulation of sequences performed in Matlab. Image were obtained considering a GRE sequence (FLASH, Fast Low Angle SHot)(matrix 32x32, slice thickness 5mm, field of view 4x4cm2, Hermitian pulse excitation 1ms) and a RARE sequence (matrix 32x32, slice thickness 5mm, field of view 4x4cm2, Hermitian pulse excitation 1ms). In both of these cases, it had been evaluated the best parameters sequence configuration in order to achieve the highest SNR. SNR was estimated as the ratio of average object contrast against background and the standard deviation of background noise. Results: This work focused on the evaluation of the GRE sequence performance for fluorine reporters detection. Sensitivity in terms of SNR is estimated both through numerical simulations and experimental scans considering optimal sequence settings, followed by the comparison between the optimal GRE acquisition and the RARE one. These analysis were preceded by theexperimental characterization of TFT and FDG relaxation times (T1, T 2*), essential for theoretical simulation and experimental scans both depending on marker properties, which are critical due to high T1 and extremely low T 2* values, typical of fluorinated compounds. Referring to GRE sequence simulation in steady state condition for both longitudinal and transversal magnetization, significant addressed parameters were repetition time, echo time (TE), and flip angle (FA). SNR was estimated vs. (TR, FA) pair, showing not to be influenced by the choice of TR, when setting the FA as Ernst Angle, which allowed maximum signal. For this reason, it was decided to select its value as lower as possible, also in the perspective to stress the comparison with a RARE sequence, characterized by higher TR. Simulation data also demonstrated the need to use lower TE in order to improve the signal, independently from TR and FA. According to this results, simulations focused on the steady state formation, evaluating the time necessary to wait for steady state thus avoiding artifacts. This time depends on FA and TR given marker’s T1. It was shown that it reached its maximum value for Ernst Angle (e.g., for TR=10ms is 7-8s) and thus decreased by using lower TR, implying lower Ernst angle. Referring to a RARE sequence simulation, significant parameters were found in repetition time and RF, given the relaxation times T1 and T2; thus demonstrating the importance of the latter and also the need for a consequent optimization of TR and RF settings. The introduction of driven equilibrium technique (known as flip back) permitted the use of lower TR, though limited at low T2/ T1 ratios. Relating to TFT relaxation times, it had been calculated that SNR reached maximum value for TR=1s and RF=20. These theoretical evidences enabled to find the best acquisition protocol for both RARE and GRE sequence. Preliminary images on phantom containing TFT were acquired with FLASH sequence, focusing on the steady state formation. Steady state was evaluated increasing the spoiler gradient amplitude along both slice selection and read out directions, while increasing the number of dummy scans. SNR was represented as function of FA using the shortest available value of TR and TE (TR=6.4ms and TE=2.1ms). In order to obtain a steady state condition (ideal condition considered in our simulations), the spoiler gradient along slice selection direction was set to 100% of its maximum value (400 mT/m), while the read out direction was not effective and accordingly switched off in further trials. Preliminary studies on SNR were also performed for no spoiler gradient, which showed larger signal, though under difficult control; maximum signal was found at a flip angle of 70°, far from the theoretical Ernst angle (7°), because of transverse magnetization accumulation through repetition, contrasting saturation at high angles. The main protocols in 19F studies are based most on RARE sequences, but GRE is also used thanks to its possibility to improve sensibility at fixed acquisition time. The comparison between GRE and RARE SNR on both TFT and FDG phantoms showed better performance of RARE sequence was assessed to be predominant, as expected. Nonetheless, the negligible sensitivity of GRE optimization to T1 relaxation times, critical in fluorinated marker and sensitive to the biochemical environment, was confirmed. Moreover, the non-ideal non steady state GRE without spoiling demonstrated significantly higher SNR, though under difficult control conditions, related to resonance phase through repetitions. Conclusions: Over the last few decades the importance of 19F MRI is increasing thanks to many comparable physical properties between 19F and 1H nuclei, but its low sensitivity poses challenging problems for the future development of this molecular imaging technique. In this thesis, the optimization of fast sequences as GRE and RARE was addressed, in order to increase this sensitivity and SNR, both through numerical simulations and experimental scans. The substantial agreement between simulations supports the correctness of the approach. In the comparison between GRE and RARE, which is easier to control and more frequently used in literature, we have successfully validated the RARE sequence as predominant. The obtained results confirm in both cases the importance of an optimization process related to relaxation times of fluorinated compounds and stress the reaching of a steady state condition in GRE sequence as a critical step. GRE was demonstrated to be negligibly influenced by relaxation times as RARE. Moreover, potential improvements by considering non-spoiled GRE were demonstrated and deserve further investigation.

Introduzione: Obiettivo principale di questa tesi è la valutazione preliminare di sequenze di tipo Gradient Echo (GRE), successivamente confrontate con sequenze di tipo Fast Spin Echo, utilizzando metodiche di 19F MRI ed acquisendo immagini di fantocci su composti di Trifluorotoluene (TFT) e Fluorodeossiglucosio (FDG) con uno scanner di risonanza magnetica ad alto campo, di intensità pari a 7T. La sensitività, in termini di rapporto segnale rumore (Signal to Noise Ratio, SNR), è stata valutata attraverso simulazioni numeriche e acquisizioni sperimentali, considerando la migliore configurazione di parametri ottenuta. La 19F MRI è una metodica a bassa sensitività, a causa del basso grado di magnetizzazione e della bassa concentrazione di atomi di fluoro (nel range del millimolare), che è necessario utilizzare per applicazioni biologiche. Per questa ragione, cresce l’interesse per il miglioramento dell’SNR, fissata la concentrazione del composto e tenendo presenti i limiti imposti sul tempo di acquisizione dal molecular imaging in vivo. Questo studio pilota si inserisce nel filone di ricerca delle applicazioni precliniche di fluoro-MRI in campo neurologico, ed è stato realizzato con la cooperazione dell’Istituto Neurologico Carlo Besta. Stato dell’arte: Le odierne tecniche di diagnostica per immagini si basano sulla rivelazione delle alterazioni anatomiche e morfologiche a livello microscopico per la caratterizzazione di una patologia, talvolta sovrapponendo informazioni di tipo funzionale. Il molecular imaging è un campo multidisciplinare, che combina al suo interno molti settori, quali la biologia cellulare, la biologia molecolare, la chimica, la medicina e la farmacologia e occupa un posto centrale nel paradigma dell’imaging funzionale e metabolico. Grazie a queste tecniche, è possibile avere una rilevazione precoce dei cambiamenti, legati a una particolare patologia a livello molecolare, utilizzando specifici reporter. Negli ultimi decenni, la 19F MRI ha guadagnato una crescente importanza negli studi biomolecolari in vivo e negli studi di tracciabilità cellulare, grazie alle sue favorevoli proprietà, quali la 100% abbondanza in natura dell’isotopo 19F, la stabilità del nucleo e la quasi totale assenza di un segnale di background nei tessuti biologici. Inoltre, il nucleo del 19F ha proprietà simili a quelle del nucleo 1H, come la sua alta sensitività relativa (0.83) e una frequenza di risonanza vicina a quella del protone (a 7T, 280.35 MHz per il nucleo del 19F e 298.032 per il nucleo del 1H). Per queste ragioni, la 19F MRI può produrre un’immagine di qualità simile a quella della 1H MRI e potenzialmente un alto rapporto contrasto rumore, qualora un composto fluorurato venga utilizzato come mezzo di contrasto. Al contrario, la bassa sensitività della MRI in generale, la potenziale tossicità e l’insolubilità in acqua possono generare dei problemi nella preparazione e nella fase di imaging di questi reporter molecolari. Le applicazioni di 19F MRI includono, ad esempio, le indagini su farmaci, la comprensione di processi infiammatori e l’analisi di fenomeni di migrazione di cellule staminali. Un grande numero di studi ha dimostrato che la sensitività è limitata dalla concentrazione millimolare, cosi che la MR è meno sensibile rispetto ad altre tecniche di medicina per applicazioni in vivo. Per questa ragione l’aumento della sensitività costituisce il principale risultato atteso per lo sviluppo della 19F MRI. In questa tesi ci siamo focalizzati su due tipi di sequenze: la sequenza Fast Spin Echo (Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement, RARE) e la GRE. La sequenza Spin Echo è la sequenza elementare della MRI, che utilizza un impulso di eccitazione a 90°e un impulso di rifocalizzazione a 180°, responsabile della formazione dell’immagine. Un’altra sequenza comunemente utilizzata è la RARE che prevede l’utilizzo di multipli impulsi di rifocalizzazione a 180°. La RARE è sequenza veloce, che permette la riduzione dei tempi di acquisizione semplicemente aumentando il numero di echi raccolti (Echo Train Length o RARE factor, RF). La sequenza GRE permette di ottenere un segnale di risonanza grazie all’applicazione di un gradiente di defasamento e a differenza della Spin Echo è governata dall'assenza di un impulso di rifocalizzazione a 180°, permettendo tempi di ripetizione (TR) più bassi e sequenze più veloci. La maggiore differenza tra la Spin Echo e la GRE è però collegata al tempo di rilassamento che caratterizza il decadimento del segnale di eco: T2 per la Spin Echo e T 2* per la GRE. A causa dell’utilizzo di TR brevi, la magnetizzazione longitudinale potrebbe non recuperare completamente il proprio valoresta, ma è possibile raggiungere una condizione di steady state, mantenendo bassi flip angle. I gradienti di spoil permettono la distruzione attiva della magnetizzazione longitudinale residua alla fine di ogni TR e il raggiungimento di una condizione di steady state per la magnetizzazione trasversa. Materiali e metodi: I campioni sperimentali si basano sull’utilizzo di fantocci contenenti 10ml di TFT puro e 50mM di FDG diluito in soluzione acquosa. Le immagini sono state acquisite con uno scanner di risonanza magnetica Biospec 70/30 USR (Bruker, Ettlingen, Germania). Questo sistema dispone di un campo magnetico principale da 7T e 30cm di diametro. E’ provvisto di un set di gradienti con schermatura attiva di 206mm (BGA-12-S) con una massima ampiezza del gradiente di 400mT/m e una bobina di volume, sintonizzabile alle frequenze di risonanza del 1H e del 19F (300MHz e 282MHz, rispettivamente). Il segnale e l’SNR teorici sono stati calcolati attraverso simulazioni numeriche delle sequenze su Matlab. Le immagini sono state ottenute, considerando sequenze GRE (FLASH, Fast Low Angle SHot) (matrice 32x32, spessore della slice 5mm, campo di vista 4x4cm2, impulso di forma Hermitiana di 1ms). In entrambi i casi, è stata valutata la migliore configurazione di parametri, per ottenere il più alto SNR, stimato come rapporto tra il contrasto medio dell’oggetto e del background e la deviazione standard del rumore calcolata sul background. Risultati: Questo lavoro si è focalizzato sulla valutazione della performance di sequenze GRE per la rilevazione di reporter fluorurati. La sensitività in termini di SNR è stata stimata attraverso simulazioni numeriche e acquisizioni sperimentali, considerando il set di parametri ottimo e confrontando successivamente la migliore acquisizione GRE con la migliore acquisizione RARE. Queste analisi sono state precedute dalla caratterizzazione dei tempi di rilassamento del TFT e del FDG (T1, T 2*), essenziali per entrambe le simulazioni teoriche e le acquisizioni sperimentali e critiche a causa degli alti tempi di rilassamento T1 e gli estremamente bassi tempi di rilassamento T 2*, tipici dei composti fluorurati. Per quanto riguarda sequenze di tipo GRE, le simulazioni in condizione di steady state per la magnetizzazione longitudinale e trasversale, hanno individuato i parametri significativi nel tempo di ripetizione, nel tempo di eco (TE) e nel flip angle (FA). L’SNR è stato stimato rispetto alla coppia di parametri (TR,FA), mostrando di non essere influenzato dalla scelta di TR, se il valore di FA corrisponde a quello dell’angolo di Ernst, che garantisce il raggiungimento del massimo segnale. Il TR è stato fissato, dunque, al valore più basso possibile, anche nella prospettiva di effettuare un confronto con la sequenza RARE, caratterizzata da TR più lunghi. Le simulazioni hanno inoltre dimostrato il bisogno di utilizzare TE più brevi per il miglioramento del segnale, indipendentemente dal TR e dal FA. Successivamente, ci si è focalizzati sulla formazione della condizione di steady state, valutando il tempo che è necessario aspettare per il raggiungimento dello stesso ed evitare in questo modo la generazione di artefatti. Questo tempo dipende dal FA, dal TR e dal tempo di rilassamento T1 del composto: raggiunge il suo massimo valore per l’angolo di Ernst (e.g. per TR=10ms è pari a 7-8s) e decresce utilizzando TR più bassi (un TR più basso, implica angoli di Ernst più bassi). Per quanto riguarda le simulazioni di sequenze RARE, i parametri significativi sono stati identificati nel TR e nel RF, fissati i tempi di rilassamento T1 e T2 del reporter: si è dimostrata l’importanza della scelta di questi ultimi e la necessità di provvedere, a posteriori, all'ottimizzazione del TR e del RF. L’introduzione di tecniche di driven equilibrium (conosciute anche come Flip Back) permettono di utilizzare TR più bassi, il cui uso è limitato da bassi valori del rapporto T2/T1. Utilizzando i tempi di rilassamento del TFT, è stato calcolato che l’SNR raggiunge il massimo valore per TR=1s e RF=20. Queste dimostrazioni teoriche hanno concesso di trovare il migliore protocollo di acquisizione sia per la sequenza RARE che per la sequenza GRE. Le immagini preliminari del fantoccio contenente TFT sono state acquisite con sequenza FLASH e si sono focalizzate sulla formazione dello steady state. Il raggiungimento dello steady state è stato valutato aumentando l’ampiezza del gradiente spoiler lungo entrambe le direzioni di slice selection e di read out e aumentando il numero di dummy scans. L’SNR è stato rappresentato come funzione del FA, utilizzando i più bassi valori di TR e di TE possibili (TR=6.4ms and TE=2.1ms). Per raggiungere la condizione ideale (considerata nelle nostre simulazioni), il gradiente spoiler lungo la direzione di slice selection è stato impostato al 100% del suo massimo valore (400 mT/m), mentre l’intensità del gradiente spoiler nella direzione di read out, considerata inefficace a tale scopo, è stata azzerata per le successive prove sperimentali. Gli studi preliminari sul SNR sono stati effettuati anche senza l’utilizzo di gradienti di spoil, mostrando di poter ottenere un segnale più alto, ma anche maggiori difficoltà nel tenere sotto controllo il fenomeno; il massimo segnale è stato misurato per un FA di 70°, distante dal valore teorico associato all’angolo di Enrst (7°), a causa dell’accumulo di magnetizzazione trasversa attraverso ogni ripetizione e a causa di effetti di saturazione per alti valori di FA. I principali protocolli per gli studi di 19F MRI si basano soprattutto sull'utilizzo della sequenza RARE, ma vengono prese in considerazione anche sequenze di tipo GRE, grazie alla loro capacità di ottenere una sensitività più alta, fissato il tempo di acquisizione. Il confronto fra GRE e RARE, per entrambi i fantocci di TFT e FDG, ha mostrato una migliore performance della sequenza RARE, così come atteso. Nonostante questo, i risultati hanno confermato anche la scarsa sensitività della GRE ai tempi di rilassamento T1, critici per i marker fluorurati che risentono dell’ambiente biochimico circostante. La sequenza GRE, utilizzata nella condizione non ideale, in assenza steady state, ha dimostrato un SNR più alto, anche se di più difficile controllo a causa dell’accumulo di fase dei fenomeni di risonanza attraverso le varie ripetizioni. Conclusioni: Negli ultimi decenni è aumentata l’importanza associata alla 19F MRI, grazie alla somiglianza delle proprietà fisiche dei nuclei di 19F e dei nuclei di 1H, ma la sua bassa sensitività costituisce un problema rilevante per lo sviluppo futuro di questa tecnica di imaging molecolare. Questa tesi è orientata verso l’ottimizzazione di sequenze veloci, come la RARE e la GRE, per il miglioramento della sensitività e dell’SNR, attraverso simulazioni numeriche e acquisizioni sperimentali. Nel confronto fra GRE e RARE, più semplice da controllare e più frequentemente utilizzata nella letteratura, abbiamo validato con successo la predominanza della sequenza RARE. Le indicazioni ottenute confermano, in entrambi i casi, l’importanza del processo di ottimizzazione, strettamente connesso ai tempi di rilassamento del composto fluorurato e riconoscono, nello stressare la sequenza GRE per il raggiungimento di una condizione di steady state, un processo critico. I risultati ottenuti dimostrano che la GRE è poco influenzata dai tempi di rilassamento del reporter e che per questa sequenza, il mancato raggiungimento di una condizione di steady state necessita di ulteriori approfondimenti.