A fully derived human placenta extract to induce the vascularization of engineered tissues

Abstract Tissue loss or end-stage organ failure due to injury/trauma, disease, or ageing is one of the most frequent, devastating, and costly problems in human health care. This issue is further exacerbated by the limited availability of transplantable tissues or organs from compatible donors. Every year Figure 1. Trend of the demand of tissue/organ transplants versus the number of available organ donors in the USA between 2000 and 2009 ( http://www.srtr.org/). the numbers rise on the organ waiting list; between 2000 and 2009, the demand for organ transplants increased 53% in the United State alone , but the actual supply of organs remained constant (Figure 1). The trend is maintained in these last years; on average, eighteen people die each day because of the shortage of donated organs. A new field, tissue engineering, may represent a revolutionary alternative to the current medical treatment, namely the transplantation, of patients affected by loss or failure of an organ or tissue. Tissue engineering applies the principles of biology and engineering to the development of functional substitutes for damaged tissue and organ. The basic concept of tissue engineering is to build tissues and organs from scratch in the laboratory (in vitro), then to transplant them into ill patients. However, the actual introduction of these engineered substitutes into the clinical practice is subordinate only to the formation of a suitable microvasculature within them in order to guarantee their long-lasting and self-sustaining after implantation in the patients. Accordingly, an effective method for angiogenesis induction is urgently needed in these tissue-engineered constructs. For this reason but not only, angiogenesis, that is a complex process through which new capillaries grow from pre-existing blood vessels under certain physiological (e.g. wound healing) and pathological (e.g. tumor growth) situations in the adult, has been widely studied in the last 20 years; then, numerous methods of promotion of the vascularization in the engineered products were tried but with unsatisfactory results. Human placenta is a highly available and accessible tissue, which is extensive vascularized and rich in extracellular matrix components. A broad assortment of proteins is offered overall placenta structure and throughout its fetal membranes. Probably because of its important endocrine function, this tissue is also a stock of growth factors, including transforming growth factor, vascular endothelial growth factor, platelet-derived endothelial cell growth factor, and human epidermal growth factor. Therefore, the freshly isolated placenta tissue can be suspected to be the most potential natural source of bioactive factors for inducing angiogenesis. The main aim of this study was to find out whether extracted components from placenta tissue are effective and useful in inducing angiogenesis to overcome the challenge of vascularization, and eventually to employing them in the formation of a microvascular system through an human processed tissue. Thus, a novel cell-free, viscous compound (PE) was extracted from a human full-term placenta with an easy derivation method. Beyond the simplicity and the quickness of this extraction procedure, PE production entailed lower costs compared with those of the matrices (e.g. Matrigel) currently used in the same research area. Placenta extract presented an high protein content; it especially contained numerous angiogenic factors, including angiogenin, adiponectin, insulin-like growth factor-binding protein 3, metalloproteinase inhibitor 2, but also a wide variety of other pro-angiogenic cytokines detected at a lower level, for example, basic fibroblast growth factor, interleukin-6, and transforming growth factor-beta 1. The ability of the placenta extract to promote in vitro formation of tubular structures was firstly Figure 2. Comparison between the different morphology of the human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded with the same density (80,000 cells/cm2) on the plastic surface of a culture plate (A) and on the placenta extract (B) and cultured for 3 days in a humidified incubator (6% CO2 and 6% at 37°C). Scale bar: 200 µm. analyzed. Endothelial cells, which are the primary constituents of the capillaries, were isolated from human umbilical vein (HUVECs) and cultured, according to different densities, on the PE for several incubation time-points. PE was shown to stimulate the organization of HUVECs in tubular structures which eventually formed capillary-like network when 80,000 HUVECs were seeded on 100 µl of PE per cm2 (Figure 2). At the third culture day, this network presented important features resembling those of the actual capillary-bed of the human tissues which were maintained for less than a week. In these conditions, genes actively involved into the physiological process of angiogenesis were expressed by the endothelial cells. For instance, an high genetic expression of fms-related tyrosine kinase 1 (FLT1) and kinase insert domain receptor (KDR) was exhibited by HUVECs. The homonymous encoded proteins are transmembrane receptors involved into initiation of angiogenesis. In addition, remodeling genes were detected. This finding allowed to support the idea that two basic phases of angiogenic process took place: the initial secretion and activation of proteolytic enzymes (MMP9 and MMP2) from HUVECs which provide to the degradation of the surrounding extracellular matrix in order to facilitate the migration of the endothelial cells toward the angiogenic factor, and the final synthesis of basement membrane components (type IV collagen) to stabilizing the neo-formed vessel. These results supported by other important outcomes demonstrated that PE selectively induced the process of angiogenesis in the endothelial cells. Therefore, PE may be a promising novel agent to be used for angiogenesis induction in engineered tissues. To evaluate this its potential, we ultimately used the PE to soak a pre-processed human tissue, namely the human umbilical vein (HUV) shown in Figure 3. The absorbed PE-biofactors attributed features resembling those of natural extracellular matrix of the human tissues to the HUV. HUVECs seeded on the PE-soaked HUV were cultured according to a static or a dynamic condition. This latter approach was carried out by using a dual-perfusion bioreactor and by undergoing the endothelial cells to a slow and continuous flow. Under static condition, HUVECs organized in tubular structures which perhaps represented the product of the initial stage of microvascular network formation (Figure 4). These immature endothelial tubules were significant in number and heterogeneously distributed on the luminal surface of the bioscaffold. The lack of a network in which the tubes arranged may further demonstrate that HUVECs only underwent the initial phase of angiogenesis guided by PE components absorbed in the HUV. On the other hand, dynamic approach did not provide the expected results. Although a lot of parameters required to be optimized, evidence about the key role of the placenta extract as a potential promoter of angiogenesis in engineered products appeared from this last experiment. The several analysis confirmed that PE has strong potential to be used for angiogenesis induction in numerous tissue engineering applications in vitro.

Sommario La perdita o l’insufficienza di un organo o tessuto, spesso conseguenti ad un trauma, ad una malattia o semplicemente all’età avanzata, rappresenta uno dei problemi più frequenti e seri della società odierna, e comporta alti costi sanitari. Oggi giorno, il trapianto d’organo costituisce una possibilità di trattamento medico e, sebbene implichi una terapia immunosoppressiva, assicura il ripristino delle normali azioni di vita quotidiana del paziente. Purtroppo, la disponibilità di tessuti e organi idonei per i trapianti è limitata. Ogni anno le liste d’attesa di organi riportano numeri maggiori. Tra il 2000 e il 2009, la domanda di trapianti ha subito un incremento del 53% soltanto negli Stati Uniti; nonostante ciò l’effettiva disponibilità di organi da donatori compatibili rimane pressoché costante (Figura 1). Ogni giorno muoiono in media diciotto persone per mancanza di organi da trapiantare. Una rivoluzionaria alternativa al trapianto, quindi possibile soluzione agli effetti collaterali ad esso connessi, potrebbe essere offerta da un campo dell’ingegneria biomedica, ovvero l’ingegneria tissutale. L’ingegneria tissutale combina i principi della biologia e dell’ingegneria allo scopo di realizzare tessuti e organi in laboratorio (in vitro) e successivamente impiantarli nei pazienti per sostituire, anatomicamente e funzionalmente, quelli malati. La concretizzazione di questa ambiziosa missione nella pratica clinica è però subordinata allo sviluppo di un’adeguata microvascolarizzazione nella maggioranza di tali organi e tessuti artificiali affinché questi possano sopravvivere e compiere le funzioni preposte. Da qui deriva l’esigenza di sviluppare un metodo che sia in grado di indurre il processo di angiogenesi nei prodotti dell’ingegneria tissutale. L’angiogenesi è il processo di crescita di nuovi capillari da vasi sanguigni preesistenti, che avviene nei soggetti adulti durante alcuni episodi fisiologici (ad esempio nella guarigione delle ferite) e patologici (così come durante la crescita dei tumori). Questo fenomeno consta di due fasi successive. Durante il primo stadio, un vaso sanguigno già esistente si dilata e le cellule endoteliali, che lo ricoprono, secernono enzimi proteolitici. Quest’ultimi, dopo essersi attivati, degradano la membrana basale del vaso e la matrice extracellulare (ECM) circostante. In questo modo viene disegnato un sentiero nella ECM attraverso cui le cellule endoteliali in proliferazione iniziano a migrare in direzione dello stimolo angiogenico. Contestualmente alla progressione delle cellule endoteliali, queste cominciano a costituire una struttura tubulare. I tubuli endoteliali stabiliscono, infine, connessioni tra di loro e con i capillari presenti nell’area raggiunta. La seconda fase, invece, comporta la stabilizzazione dei tubuli endoteliali che si sono formati. Tali capillari immaturi vengono ricoperti da cellule perivascolari, ovvero dai periciti, i quali stabiliscono contatti con le cellule endoteliali e sintetizzano la membrana basale intorno ai nuovi capillari. Di conseguenza, le cellule endoteliali arrestano la loro proliferazione e migrazione divenendo quiescenti. I neo capillari iniziano così ad assolvere alle loro funzioni. La conoscenza del processo di angiogenesi è stata approfondita negli ultimi venti anni, incoraggiando anche lo studio e la realizzazione di nuovi procedimenti volti ad indurre la vascolarizzazione dei tessuti ingegnerizzati. La matrice extracellulare e alcuni fattori bioattivi svolgono un ruolo fondamentale nel processo di angiogenesi, in quanto forniscono stimoli essenziali alle cellule. Partendo da questo assunto, si è cercato di riprodurre in vitro un ambiente simile a quello in cui si svolge tale fenomeno. Di conseguenza, si è pensato di ricercare un tessuto umano che potesse essere una sorgente di tali elementi promotori dell’angiogenesi. La placenta umana, dotata di un’ampia e fitta rete vascolare, nonché di una vasta varietà di proteine caratteristiche della matrice extracellulare e di fattori di crescita, si è rivelata essere idonea a questo scopo. Trattasi inoltre di un tessuto scarsamente utilizzato nella attuale pratica clinica, perciò facilmente reperibile. L’obiettivo principale del presente lavoro di tesi è stato scoprire se gli elementi estratti dalla placenta potessero essere realmente efficaci e utili nella promozione del processo di angiogenesi, con lo scopo finale di impiegarli nella vascolarizzazione di un tessuto umano. Tale lavoro di tesi si è strutturato in tre fasi. Nella prima è stato identificato un procedimento di estrazione dei componenti dalla placenta umana, i quali sono stati in seguito caratterizzati. Una successiva indagine è stata quindi condotta al fine di valutare la risposta delle cellule endoteliali, principali costituenti dei capillari, agli stimoli offerti dagli elementi estratti dalla placenta. Nella seconda parte sono state eseguite alcune analisi sull’estratto di placenta mirate a dimostrare la sua effettiva capacità di promuovere angiogenesi. Nell’ultima sezione, l’estratto di placenta è stato utilizzato nel tentativo di vascolarizzare un tessuto umano. Nella fase iniziale, è stato formulato ed adottato un metodo di derivazione per estrarre un composto viscoso e privo della componente cellulare dalla placenta umana. L’estratto di placenta (PE) è caratterizzato da un alto contenuto di proteine, in particolare da un’elevata concentrazione di citochine angiogeniche, tra cui l’angiogenin, l’adiponectin, l’insulin-like growth factor-binding protein 3 e il metalloproteinase inhibitor 2, oltre che da un’ampia varietà di altri fattori di crescita, come il basic fibroblast growth factor, l’interleukin-6 e il transforming growth factor-beta 1. Il ruolo di tali biofattori è stato indagato in vitro: le cellule endoteliali, isolate dalla vena ombelicale umana (HUVECs), sono state coltivate con densità diverse sul PE con differenti tempi di incubazione. Le HUVECs hanno risposto rapidamente agli stimoli offerti dal PE formando network di strutture tubulari simili alle fitte reti di capillari che pervadono i tessuti corporei. Tale reazione cellulare è risultata ottimale in specifiche condizioni, ovvero quando 80,000 HUVECs sono seminate su 100 µl di PE per cm2 e mantenute in coltura per tre giorni (Figura 2). Nelle suddette circostanze, l’espressione genica delle HUVECs è stata quantificata mediante la tecnica di real-time PCR. Geni solitamente attivi nel processo fisiologico di angiogenesi sono stati identificati, tra i quali il fms-related tyrosine kinase 1 (FLT1) e il kinase insert domain receptor (KDR). Questi infatti codificano per gli omonimi recettori transmembrana implicati nella fase di innesco del medesimo fenomeno. Ulteriori geni coinvolti nel rimodellamento della matrice extracellulare sono stati individuati nelle cellule endoteliali, fornendo una prova aggiuntiva del fatto che le HUVECs sono sottoposte ad angiogenesi se coltivate sul PE. Infatti, l’espressione di quest’ultima categoria di geni è stata ricondotta alla manifestazione di due fasi essenziali del processo di angiogenesi nelle HUVECs. Si tratta dell’iniziale secrezione e attivazione di enzimi proteolitici (MMP9 and MMP2), i quali degradano la matrice extracellulare circostante per facilitare la migrazione delle cellule verso lo stimolo angiogenico, e della conclusiva sintesi di alcuni componenti della membrana basale (collagene di tipo IV), che stabilizzano il vaso sanguigno dopo la sua formazione. Tali risultati ed altri aggiuntivi hanno avvalorato l’ipotesi di partenza, ossia i componenti dell’estratto di placenta promuovono selettivamente il processo di angiogenesi nelle cellule endoteliali. Il PE è stato quindi considerato come un nuovo promettente agente nell’induzione del processo di angiogenesi in vitro. Il potenziale ruolo del PE è stato quindi esaminato sui tessuti ingegnerizzati. La vena ombelicale umana (HUV) è stata scelta in questo contesto. Quest’ultima è stata prima di tutto processata attraverso i tre seguenti step: dissezione, decellularizzazione e liofilizzazione (Figura 3); tali procedure sono descritte in dettaglio nel capitolo 2. Lo scaffold ottenuto è stato quindi immerso nel PE affinché i biofattori costituenti il PE venissero assorbiti dalla HUV conferendole caratteristiche analoghe a quelle della naturale matrice extracellulare. Le HUVECs sono state allora seminate nel lume della HUV e coltivate secondo due diversi approcci, statico e dinamico. In condizione statica, le HUVECs, al quinto giorno di coltura, si sono organizzate in strutture tubulari immature distribuite eterogeneamente sulla superfice del bioscaffold senza però formare network (Figura 4). La mancata creazione di un network è stata attribuita al fatto che le HUVECs, guidate dai componenti del PE, sono solo state sottoposte alla fase iniziale del processo di angiogenesi. L’approccio dinamico è stato eseguito utilizzando un bioreattore (Figura 5) progettato per la doppia-perfusione di costrutti tubulari e sottoponendo le cellule endoteliali, adese alla HUV, ad un flusso lento e continuo. Al termine dei cinque giorni di coltura, è stato osservato un cambiamento nella morfologia delle cellule endoteliali probabilmente determinato dallo stimolo combinato del PE e del flusso. Una futura ottimizzazione dei parametri di coltura dinamica ed ulteriori esperimenti potranno rafforzare il ruolo del PE nella promozione dell’angiogenesi nei costrutti ingegnerizzati. Le analisi condotte in questo lavoro di ricerca hanno provato che l’estratto di placenta (PE) ha un elevato potenziale nell’induzione dell’angiogenesi in numerose applicazioni in vitro. Pertanto le sue promettenti caratteristiche ben si prestano a vincere la sfida dell’ingegneria tissutale relativa alla progettazione e realizzazione della vascolarizzazione in costrutti artificiali.