Circadian variations in the hippocampus of epileptic rats

Epilepsy is the most common primary disorder of the brain, and, according to the World Health Organization, is one of the leading causes of neuropsychiatric disability worldwide, along with depression. Since the late 19th century it has been observed that epileptic seizures tend to occur at specific times of day, thus suggesting a link between circadian rhythms and epilepsy. However, a thorough understanding of such relationship and its extent is still lacking. This thesis engages in investigating the circadian variations, in terms of frequency rhythms in the EEG signal, in the hippocampus of epileptic rats, during a seizure-free period in the chronic phase of the disease. The epileptogenic process, which originates from a cerebral lesion, is divided in two phases: latent and chronic. During the latent phase epileptic symptoms are not observable; this phase ends when the first spontaneous epileptic seizure occurs, marking the beginning of the chronic phase, where epileptic symptoms are visible. Several biologic processes display an approximately 24 hours rhythmicity, which is called circadian (from the latin circa dies, “almost a day”). These endogenous rhythms are due to the presence of a biologic clock, the circadian pacemaker, whose principal component is the Supra-Chiasmatic Nucleus, which is responsible of the entraining of the endogenous clock employing environmental cues (zeitgebers), among which light is the most relevant. Gowers was the first to record that epileptic seizures tend to occur at specific moments of the day, such as in the morning at arousal or in the night during sleep [1]. Recent studies carried out in Dr. Carney’s Epilepsy Research Lab (at the University of Florida) have shown a phase-shift in the circadian modulation of EEG features in the CA1 region in an animal model of TLE, during the latent period of the disease [31, 32, 33]. This study, extending from there, aims at investigating the presence of a similar phase-shift during the chronic phase of the disease. In-vivo intra-hippocampal recordings were performed on rats, employing 32 microwire electrodes. Following one week of baseline EEG recordings, the animals underwent continuous electrical stimulation, with the purpose of inducing brain injury leading to spontaneous seizures. The animals were kept in a controlled environment with symmetric day/night cycles (lights on at 6 am, lights off at 6 pm) and continuously monitored with a video recording. Spectral analyses was carried out on these recordings, considering the frequency range 0-100 Hz, which includes all the most relevant hippocampal EEG rhythms (theta: 3-11 Hz, beta: 12-29 Hz, gamma 30-70 Hz, high gamma 71-100 Hz). The circadian modulation of the spectral power of these bands was considered and comparisons were drawn between the pre-injury period and the seizure-free period in the chronic phase of the disease. To estimate the spectra, the discrete Fourier transform (DFT) with a Hamming window was applied to chunks of signal of duration of 10 seconds, in order to handle the non-stationarity of the EEG signal over longer periods. The spectra estimated in this way were then averaged over an hour, yielding the hourly average spectral power for each of the bands considered; this was done over 4-6 days’ worth of data both before stimulation and in the chronic phase. To underline the circadian modulation, the data, consisting of the series of the hourly spectral power averages, was de-trended and the 24 hours cycle were averaged over a few days and then fitted with a sinusoid. This was done in order to find during which part of the day the peak values for each band were reached, comparing the results before the stimulation and in the chronic phase. Finally the relative variation in the spectral power of the single band with respect to the total spectral power and of the single band before the stimulation with respect with the chronic phase was taken into account. At the end of this study a phase-shift in the circadian modulation of the beta rhythm was observed. This confirmed that the phase-shift observed in the latent period is not a transitory phenomenon, but is still present in the chronic phase of the disease, leading to new and interesting hypothesis that will be later discussed in this thesis. The organization of the thesis is the following: • Introduction: the chapter introduces the basic concepts to understand the development and aim of the thesis; in particular, the essential information about epilepsy (both in general and on temporal lobe epilepsy), circadian rhythms and the hippocampus (with a particular focus on the CA1 region and the principal EEG rhythms with their relevance) is given. • Experimental Design: the chapter describes the protocol followed and the experimental set-up, focusing on the principal aspects of the animal model employed. • Data Analysis: the chapter describes the methodologies employed for the analysis of the experimental data. • Results: in this chapter the results of the study are presented. • Conclusions: in the chapter the results presented before are commented and some hypotheses are presented. • Future developments: finally, in this chapter, possible future studies with the capability of adding new information and verifying the hypotheses presented before are presented.

L’epilessia e’ il piu’ diffuso disordine primario del cervello ed una delle principali cause di disabilita’ neuropsichiatrica, insieme alla depressione, secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanita’. Sin dalla fine del diciannovesimo secolo e’ stato osservato che le crisi epilettiche tendono a presentarsi in precisi momenti della giornata, suggerendo un possibile legame fra epilessia e ritmi circadiani. Tuttavia una spiegazione esaustiva del fenomeno e delle sue possibili implicazioni non e’ ancora stata raggiunta. Questa tesi analizza le variazioni circadiane, in termini di ritmi di frequenze nel segnale EEG, nell’ippocampo di ratti epilettici, durante un periodo in cui non si sono presentate crisi, nella fase cronica della malattia. Il processo di epileptogenesi, originato da una lesione cerebrale, si suddivide in due fasi: latente e cronica. Durante la fase latente non sono osservabili i sintomi dell’epilessia; tale fase si considera terminata quando insorge il primo attacco epilettico spontaneo, che marca l’ingresso nella fase cronica, in cui i sintomi della malattia sono osservabili. Svariati processi biologici presentano una ritmicita’, del periodo di circa 24 ore, che viene percio’ definita circadiana (dal latino circa dies, “circa un giorno”). La presenza di questi ritmi endogeni e’ dovuta alla presenza di un orologio biologico, il pacemaker circadiano, il cui componente principale e’ ritenuto essere il Nucleo Supra-Chiasmatico, che e’ anche responsabile dell’aggiustamento del clock endogeno e sfrutta alcuni fattori ambientali (zeitgebers), fra i quali la luce risulta il piu’ rilevante. Gowers fu il primo a registrare come gli attacchi epilettici si verificassero in precisi momenti della giornata, quali il mattino in prossimita’ del risveglio o la notte durante il sonno [1]. Studi recenti [31, 32, 33] nel Laboratorio di Ricerca sull’Epilessia del Dott. Paul Carney (presso University of Florida), hanno evidenziato come sia osservabile uno sfasamento nella modulazione circadiana dell’attivita’ neurale nella regione CA1 dell’ippocampo di ratti epilettici durante la fase latente della malattia. Lo scopo di questa tesi e’ di espandere i risultati precedentemente ottenuti, investigando la fase cronica, per verificare se questo sfasamento fosse ancora presente. Pertanto sono stati registrati in-vivo i segnali elettroencefalografici provenienti dall’ippocampo di alcuni ratti, usando un array di 32 micro-elettrodi. Dopo aver acquisito un’intera settimana di tracciati EEG continui sui ratti sani, questi sono stati sottoposti a stimolazione elettrica al fine di indurre una lesione cerebrale che avrebbe portato allo sviluppo dell’epilessia del lobo temporale. Gli animali sono stati mantenuti in un ambiente controllato con cicli giorno/notte simmetrici (luci accese dalle 6 alle 18) per tutta la durata dello studio, durante il quale sono anche stati continuamente monitorati con registrazioni video, oltre che EEG. E’ stata poi applicata un’analisi spettrale sui tracciati EEG cosi’ ottenuti, considerando un range di frequenze da 0-100 Hz, nel quale sono racchiusi tutti i principali ritmi elettroencefalografici dell’ippocampo (theta: 3-11 Hz, beta: 12-29 Hz, gamma 30-70 Hz, high gamma 71-100 Hz). E’ stata presa in considerazione la modulazione circadiana della distribuzione della potenza spettrale fra le diverse bande e sono stati paragonati i dati relativi al periodo precedente alla lesione e a quello successivo alla prima crisi spontanea. Per la stima degli spettri si e’ fatto ricorso alla trasformata di Fourier discreta (DFT) su spezzoni di segnali della durata di 10 secondi, per ovviare alla non stazionarieta’ del segnale EEG su periodi piu’ lunghi, dopo aver applicato una finestratura di Hamming. Gli spettri cosi’ ottenuti sono stati poi mediati su un arco di un’ora, ottenendo il valore medio orario della potenza spettrale di ognuna della bande considerate; cio’ e stato eseguito su una mole di dati pari a 4-6 giorni di registrazioni continue sia prima della stimolazione che nella fase cronica. Per evidenziare la modulazione circadiana, si e’ prima eseguita una operazione di de-trending, per eliminare la deriva della linea di base, poi i cicli di 24 ore sono stati mediati su diversi giorni ed infine si e’ ricorso ad un fitting sinusoidale. Cio’ e’ servito ad andare ad individuare durante quale parte della giornata fossero raggiunti i valori di picco per le diverse bande, andando a confrontare i risultati prima della stimolazione e durante la fase cronica. Infine sono state prese in considerazione le variazioni relative nel potere spettrale della singola banda rispetto al potere spettrale totale e della singola banda prima della stimolazione rispetto alla fase cronica. Alla fine di questo studio e’ stato osservato uno sfasamento della modulazione circadiana nel ritmo beta. Cio’ ha confermato che lo sfasamento osservato nella fase latente non e’ un fenomeno transitorio, ma altresi’ persiste durante la fase cronica, aprendo nuove ed interessanti ipotesi, che saranno illustrate in seguito. L’organizzazione della tesi e’ la seguente: • Introduzione: il capitolo introduce i concetti fondamentali per comprendere lo svolgimento e lo scopo della tesi; in particolare vengono forniti alcuni dati essenziali relativi all’epilessia (sia in generale che piu’ approfonditamente sull’epilessia del lobo temporale), ai ritmi circadiani ed all’ippocampo (con particolare attenzione per la regione CA1 e per i principali ritmi EEG ed il loro significato). • Design Sperimentale: il capitolo descrive il protocollo seguito ed il set-up sperimentale, soffermandosi sugli aspetti principali del modello animale impiegato. • Analisi dei Dati: il capitolo tratta le metodologie impiegate per l’analisi dei dati sperimentali, fornendo una concisa descrizione delle stesse e soffermandosi sugli accorgimenti necessari per il loro utilizzo in questo progetto. • Risultati: in questo capitolo sono presentati i risultati dello studio descritto in questa tesi. • Conclusioni: in questo capitolo i risultati precedentemente illustrati vengono commentati ed alcune ipotesi, da essi scaturite, vengono presentate. • Sviluppi Futuri: infine, in questo capitolo, sono descritte alcune linee di ricerca che potrebbero essere seguite al fine di acquisire nuove informazioni e di sottoporre a verifica le ipotesi introdotte precedentemente.