Ottimizzazione delle tecniche di coltura in vitro di cellule staminali mesenchimali per l’ingegneria del tessuto cartilagineo

Introduction Cartilage degeneration caused by congenital abnormalities or diseases and injuries, it’s of great clinical interest, given the limited intrinsic healing potential of the tissue. Due to the absence of vascularity cartilage damages (chondral lesions) can’t be repaired by chondrocytes situated locally. In case of articular cartilage whole thickness lesions, osteochondral lesions, a normal inflammatory response is activated, but causes the formation of fibrocartilage. To prevent the progressive degeneration of articular pathologies such as osteoarthritis, surgery is often the only option (1). In clinical environment there are procedures based on the biological repail of articular cartilage in order to avoid the replacement of the joint. Those procedures are intended to fill the defect and restore the articular surface. Current clinical strategies as mosaicplasty, microfracture, ACI and its evolution, MACI, are unsatisfactory. One of the reasons for their limited clinical success is given by the fact that these treatments require the formation of new cartilage tissue at the site of the lesion. Furthermore, the newly formed tissue does not possess the same structural organization of the native cartilage and the mechanical properties are inferior, so it is destined to fail (2). The most promising method to overcome this problem is represented by tissue engineering, which has the purpose to produce ex vivo a mechanically stable cartilage to be subsequently implanted into damaged tissue areas. Tissue engineering techniques consist into an effective interaction between three components: the scaffold, on which the cells are seeded to create the physical form of tissue, cells, which synthesize the matrix, and chemical and mechanical signals, which direct the cells to express the desired tissue phenotype. The first step for the tissue reconstruction in vitro is to isolate the cells from the tissue of a donor by biopsy. In the articular cartilage the only cellular component is represented by chondrocytes, which synthesize extracellular matrix, composed of a complex network of highly hydrated molecules. However, the number of cells recovered from the biopsy is not sufficient, thus the cells need to be expanded. When the isolated chondrocytes are placed into bidimensional culture for proliferation, they undergo a morphological and to a loss of biochemical and functional properties. However this process is reversible. In fact, the dedifferentiated chondrocytes can recover their phenotype when they are relocated into three-dimensional environment. (3) The most common three-dimensional culture systems are: pellet culture system, cell encapsulation into hydrogel spheres and microcarriers. Another problem of chondrocytes is their poor availability and limited proliferative capacity, so in cartilage tissue engineering it is preferred to use mesenchymal stem cells as an alternative cell source. In this thesis we want to evaluate innovative methods for the expansion / differentiation to propose solutions to the problem of the cell source availability. It’s been assessed a pellet co-culture of chondrocytes and mesenchymal stem cells isolated from the same or different patients and with different ages. We want to test the possibility to enhance the viability, proliferation and chondrogenic induction of the coculture compared to monoculture. Furthermore, we want to evaluate the expansion of mesenchymal stem cells as an alternative source of chondrocytes for the reconstruction of cartilage in Oscillating Perfusion Bioreactor (OPB) with two different techniques: surface collagen coating of OPB chamber and collagen microcarriers in suspension inside the OPB bioreactor. Materials and methods • Co-culture For the experiment of co-culture chondrocytes and mesenchymal stem cells were isolated from six different patients (all of the same sex to reduce the variability of results), subject to total hip replacement. Patients were divided into two groups according to their age. With the cells of each donor it was made a static three-dimensional pellet culture , composed from a single cell line (100% BMSC and 100% chondrocytes), or from a combination of the two (75% BMSC -25% chondrocytes and 50 %BMSC-50% chondrocytes). In the combination of the two cell lines, co-culture, the cells may belong either to the same donor or to different donors, but always belonging to the same group. The chondrocytes are expanded up to second passage, while the mesenchymal stem cells up to third passage. We used a cell density of 4x10 ^ 5 cells / pellet. The cells are cultured with serum free medium (DMEM with 1% NaP, 1% Hepes, 1% of PSG (Penicillin Streptomycin Gentamycin) and 1% ITS (Insulin Transferrin Selenium) to which are added Dexamethasone (0.1 uM ), TGF β 1 (Transforming Growth Factor β 1) (10ng/ml), 0.1 mM ascorbic acid and 0.4 mM proline for 14 days in the incubator at 37 ° C, in conditions of steam saturation and 5% CO2 with the cap slightly unscrewed. At the end of the culture it has been evaluated cellular metabolic activity in the different experimental conditions using Alamar Blue assay, and it has been quantified the content of DNA by the CyQuant assay to see which culture condition induces better cell proliferation. Furthermore it was performed an analysis of the amount of glycosaminoglycans to evaluate the chondrogenic potential of stem cells in the different experimental conditions. • Culture in OPB A method for cell expansion evaluated was the collagen coating of the OPB chamber. To achieve the collagen coating of the silicone chamber inner wall preliminary tests have been performed on silicone disks. To improve the condition of adhesion of the collagen coating on the surface of the silicone tube and to make its surface more hydrophilic an amination of the tube surface was made with Flexicel protocol. For the preparation of collagen was used a rat tail collagen liquid solution (BD Bioscences) from High and Low Concentration stock solution. It has been tested the coating of the silicone tube and slides with a solution of collagen at three different concentration (1mg/ml, 3 mg / ml and 5 mg / ml). Cell density used is 10,000 cells/cm^2. The cells are left in culture with BMSC complete medium for a week. At the end of culture it was made an analysis of the cell viability using Alamar Blue assay to see if the cells are located in a favorable environment within the collagen and cell proliferation was evaluated within the gel via Cyquant assay. To analyze the efficiency of cell recovery of viable cells from the gel were analyzed three different collagenase conditions: 15 mg / ml for 15 minutes, 5 mg / ml for 5 and 15 minutes. LIVE / DEAD assay was also performed to analyze the cellular distribution within the gel. The other method of cell expansion evaluated is the expansion of mesenchymal cells on microcarriers of collagen in suspension in the OPB. The collagen microcarriers used in this work were fabricated at the Bioengineering Laboratories Spa (BEL). Tests of wettability of the substrate in the culture medium were made and degradation in culture medium was assessed to test the resistance of the support by estimating the degradation of the microcarriers at 7 and 14 days. It was also evaluated the enzymatic degradation in high concentrated collagenase solution(15 mg / ml) to test the possibility of recovering the cells from microcarriers. Thus to test the possibility to use microcarriers within the bioreactor was carried out a test of buoyancy of the material. It has been realized an ad hoc chamber consisting of a connector window closed by a steel ring with circular slide, which allows an easy introduction of microcarriers through laboratory pipette, and a connector, diametrically opposite, luer-lock type with a metal mesh of 100 micron to prevent the escape of microcarriers during a possible change of the culture medium. The microcarriers, after a preconditioning in culture medium, were placed within the bioreactor and 10 ml of medium are added. The speed of the bioreactor was set to 1000 µm/s and the oscillation to 270 °. Subsequently test of cellular validation were carried out with both MG63, as they provide a high repeatability and a good reproducibility of the experiments, and with MSC because more relevant for future clinical applications. The validation tests were carried out using collagen disks on which are seeded 15 000 cells. The monitoring times are 24 and 48 hours. To assess the biocompatibility of the microcarriers an analysis of cell viability using Alamar Blue has been made and to see if the mesenchymal cells are able to proliferate in collagen support a measure of DNA content by CyQuant assay was performed. Other 9 discs seeded with MG63 cells at 48, 72 and 168 hours are used for qualitative analysis of cell morphology using MTT assay to see if the cells penetrate and proliferate within the disk, and if their distribution is uniform. Once characterized the material, was made an experiment of dynamic culture with mesenchymal stem cells. The cell densities evaluated were 40,000 cells/cm^2 and 10000 cells/cm^2 with two different monitoring times, respectively 5 and 9 days. The OPB speed rotation is 1000μm/s and the oscillation angle 270 °. At the end of each experiment an analysis of cell viability and proliferation assays were carried out for the estimation of cells recovery efficiency from microcarriers. LIVE / DEAD assay was also performed to evaluate the uniformity of distribution and the cellular viability on microcarriers. Results • Co-culture For each sample constituted by the co-culture of chondrocytes and mesenchymal stem cells the CI index was calculated, an index of chondrogenic induction, in order to better assess any improvement in cell viability, proliferation and chondrogenic capacity of the stem cells of the co-culture compared to monoculture. If this value is greater than one, then the chondrogenic induction is favored, vice versa if it is less than one. From the results obtained from the co-culture after 2 weeks there has been no statistically significant difference (p> 0.05) in the values of viability between cells belonging to the same donor or different donors for both the first and the second group of patients. For both groups the trend of the two different cell ratios, 50% BMSC-50% AC and 75% BMSC-25 % AC, is similar. The CI index values for the proliferation and cells vitality belonging to the same patient or different patients are quite similar and higher than one. In both groups the trend of chondrogenic induction for 75% BMSC-25%AC and 50% BMSC-50 % AC combination is the same. And the CI index values in cases of cells belonging to the same donor or different donors are quite similar, although there is no samples with CI index higher than one. • OPB culture A culture system evaluated for the expansion of mesenchymal stem cells in OPB is the collagen coating of the inner surface of the OPB. The tests performed on mesenchymal cells seeded on silicone tube coated in three different concentrations (1mg/ml, 3 mg / ml and 5 mg / ml) from two different stock solutions, High Concentration(HC) and Low Concentration (LC), showed that cells were viable with values quite similar on LC and HC collagen stock solutions. Among the different concentrations, the values of viability were slightly higher in the case of collagen coating concentration of 3mg/ml both HC and LC. The mesenchymal stem cells seeded on the silicone tube proliferate with levels similar to the case of silicone tube coated with 1mg/ml collagen both HC and LC, even if the values are slightly lower then 3 mg / ml HC and 5 mg / ml HC. From the Live &Dead images (see Figure 1) it can be seen how the cells are viable and proliferate on the collagen coating and in the case with concentration of 1mg/ml LC cells seem to assume a more uniform distribution than the other concentrations. The other culture system for the expansion of mesenchymal cells is represented by collagen microcarriers in suspension in OPB bioreactor. From characterization tests it was seen that even after two weeks on culture medium the microcarriers were still about 80% of their initial weight and degrade after 1 minute in a highly concentrated collagenase type I solution (15mg/ml) until they get to 20% of their initial weight. After 24 hours preconditioning in culture medium the microcarriers, inserted in the bioreactor at a speed of 1000μm / s with a swing of 270 º ,exhibited an inhomogeneous behaviour. A variable portion of microcarriers remains on the bottom of the chamber during rotation while the other portion of microcarriers, which consists of microcarriers not completely wet, tends to follow the air bubble and to adhere to the wall of the chamber. From the tests of cellular validation, made with collagen disks, it was seen that the cells proliferate on the whole disc and are distributed evenly over the entire surface. The material resulted therefore sufficiently porous for cell migration (see Figure 2). After material characterization, an experiment was made cultureing to 5 and 9 days in OPB mesenchymal stem cells seeded onto microcarriers at two different cell densities, 10000cells/cm^2 and 40000cells/cm^2. The cells seeded in this support are vital and proliferate more when seeded at a density of 40000 cells/cm^2 (see Figure 3). Discussion From the experiments of co-culture in pellet system of chondrocytes and mesenchymal stem cells it was seen as there was no difference in terms of cell viability, proliferation and chondrogenic induction between co.cultures with cells from the same and from different donors, no difference was also seen between different cells ratio. However in some cases the levels of viability and cellular proliferation appear to be more favorable in combinations with cells isolated from different patients compared to those isolated from the same patient. This would be an advantage, asin view of an allogenic approach using heterologous chondrocytes (or mesenchymal stem cells) to solve the problem of cell source cell. The use of bioreactors allows to improve the quality, reproducibility, uniformity and the process of seeding efficiency compared to the static methods. (4) It also allows to maintain the desired concentration of gas and nutrients in the culture medium, facilitating mass transport through the construct and exposing it to physical stimuli. In this thesis, we tested the possibility to expand mesenchymal stem cells within the bioreactor OPB. One approach consisted in the expansion of mesenchymal stem cells on collagen coating performed on the inner wall of the OPB chamber. In the literature, there are studies in which mesenchymal stem cell were seeded and expanded on collagen gels for cartilage regeneration (5) but also for various applications such as tendons (6), and bone tissue engineering (7). The concentrations of the collagen gel used in the literature for the culture of mesenchymal stem cells are 3mg/ml (8), 2.5 mg / ml and 5 mg / ml (5) In this thesis mesenchymal stem cells were cultured for one week on three different collagen gel from two different stock solution, high and low concentrations. Similarly to the study carried out by Deorsan (2010) (5), in which, however, the stem cells were seeded on collagen gel with concentration of 2.5 mg / ml and 3 mg / ml, the cells are viable and proliferate. From the images of Live & Dead seemed, however, that the cells proliferated and adhered better to the substrate with a collagen concentration of 1 mg / ml obtained from low concentration stock solution. Investigating three different conditions of collagenase it was seen that the solution of collagenase at low concentration (5mg/ml) with a time of action of 15 minutes allows to recover a higher number of viable cells. So we can easily recover the cells from the support disrupting the gel without damaging the cells by using a solution of collagenase less concentrated. Another type of support for the cell expansion evaluated were microcarriers. In the market there are different types of microcarriers: porous and non-porous, made of collagen, gelatin, glass. In literature, there are several studies that have demonstrated the ability to expand mesenchymal stem cells seeded onto Citodex, a matrix of dextran (9) (10), or of Cultispher-G (11) (12), gelatin, and cultured in spinner flask. In a study in the literature it was compared proliferation and cell recovery from various types of microcarriers (cytodex 1, cytodex 3, collagen, hillex) after 5 days in the bioreactor, showing how even if the levels of proliferation were higher in the case of mesenchymal stem cells seeded onto Citodex, one could recover a high number of viable cells also from collagen microcarriers (13). I this work we thus evaluated the cell expansion in a new type of porous collagen microcarriers in suspension in the OPB. As we have seen in a study by Goldstein et al. (2001), where a perfusion bioreactor and a spinner flask were compared, the perfusion has proven best for the transport of the fluid. In fact, using the same flow rate, the same type of scaffold and the same cell density, the perfusion bioreactor, compared to the spinner flask, had a cellular distribution more uniform in the scaffold and viable cells throughout its volume. (14) From the results obtained it was seen that the microcarriers of collagen even after 2 weeks in culture medium continue retain 80% of their initial weight demonstrating therefore the adequacy of the support for a period compatible with cell expansion. Furthermore, after 1 minute in a highly concentrated collagenase solution they degraded rapidly up to 20% of their initial weight, allowing, therefore, a fast cell recovery from the support. The material is also sufficiently porous to allow the migration and proliferation of cells throughout the construct, with a relatively even distribution. As other porous microcarriers present on the market, this material allows to expand a large number of cells inside using a support of reduced dimensions. The cells on microcarriers seeded and grown in a bioreactor to 5 days have vitality higher than the static culture. Compared to the density of 10000 cells/cm^2, the cells seeded at a density of 40000 cells/cm^2 proliferate more over time. Conclusions The co-culture of chondrocytes and mesenchymal stem cells is more advantageous than the monoculture. There are also no age-related difference between donors. In some cases the combination between cells of different donors is better than that with cells from the same donor. A collagen coating of silicone tube for mesenchymal stem cells performed well as a method for cell expansion, favoring the viability and cell proliferation mainly in the case of coating with a concentration of 1mg/ml LC. In addition, it allowed an easy cell recovery due to the easy disintegration of the material also with a less concentrated collagenase solution. The microcarriers were found to be a resistant culture material, porous and easily degradable in collagenase, allowing easy cell recovery. As well as collagen coating, they can be proposed as a support for culture of mesenchymal stem cells favoring their viability and proliferation, especially with 40000 cells/cm^2 density. Bibliography 1. 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Introduzione La degenerazione della cartilagine, causata da anomalie congenite o malattie e traumi, è di grande interesse clinico, dato il limitato potenziale di guarigione intrinseco del tessuto. A causa della vascolarizzazione assente i danni alla cartilagine (le lesioni condrali) non possoro essere riparati dai condrociti situati localmente. Nel caso di lesioni su tutto lo spessore della cartilagine articolare, quindi di lesioni osteocondrali, si attiva una normale risposta infiammatoria, ma causa la formazione di fibrocartilagine. Per evitare la progressiva degenerazione articolare di patologie come l'osteoartrosi, l'intervento chirurgico è spesso l'unica opzione (1). Per non sostituire completamente l’articolazione esistono in ambito clinico delle procedure di riparazione biologica della cartilagine articolare che hanno l’obiettivo di riempire il difetto e di ripristinare la superficie articolare. Le attuali strategie cliniche come mosaicoplastica, microfrattura, ACI ed una sua evoluzione, il MACI, risultano poco soddisfacenti. Uno dei motivi del loro limitato successo clinico è dato dal fatto che questi trattamenti richiedono la formazione del nuovo tessuto cartilagineo nel sito della lesione. Inoltre, il nuovo tessuto appena formato non possiede la stessa organizzazione strutturale della cartilagine nativa e le proprietà meccaniche sono inferiori, quindi è destinata a fallire (2). Il metodo più promettente per superare questo problema è rappresentato dall’ingegneria dei tessuti, che ha lo scopo di produrre ex vivo una cartilagine meccanicamente stabile da impiantare successivamente nella zone del tessuto danneggiato. Le tecniche dell’ingegneria tessutale implicano un’efficace interazione tra tre componenti: lo scaffold, su cui vengono seminate le cellule per creare la forma fisica del tessuto, le cellule, che sintetizzano il tessuto, e i segnali chimici e meccanici, che indirizzano le cellule a esprimere il fenotipo tissutale desideratoIl primo step per la ricostruzione di un tessuto in vitro consiste nell’isolare le cellule dal tessuto di un donatore tramite biopsia. Nella cartilagine articolare l’unica componente cellulare è rappresentata dai condrociti, che sintetizzano matrice extracellulare, composta da una complessa rete di molecole altamente idratate. Tuttavia il numero di cellule recuperate dalla biopsia non è sufficiente, quindi le cellule vanno espanse. Quando i condrociti isolati vengono messi in coltura bidimensionale per la proliferazione, essi vanno incontro ad una modifica della loro morfologia e ad una perdita delle sue proprietà biochimiche e funzionali. Tuttavia questo processo è reversibile. Infatti, i condrociti dedifferenziati possono recuperare il loro fenotipo quando vengono ricollocati in un ambiente tridimensionale. (3) I sistemi di coltura tridimensionali più diffusi sono: il sistema di coltura pellet, incapsulamento cellule in sfere di idrogel ed i microcarriers. Un altro problema dei condrociti è la loro scarsa disponibilità e limitata capacità proliferativa, per questo nell’ingegneria del tessuto cartilagineo si preferisce utilizzare le cellule staminali mesenchimali come fonte cellulare alternativa. In questo lavoro di tesi si vogliono valutare metodiche innovative per l’espansione/differenziamento cellulare nell’ottica di proporre soluzioni per il problema della disponibilità della fonte cellulare. Viene valutata una metodica di cocultura in sistema di tipo pellet tra condrociti e cellule mesenchimali staminali appartenti allo stesso paziente o a pazienti differenti e di età diffente. E si vuole testare la possibilità di migliorare la vitalità, la proliferazione e l’induzione condrogenica rispetto alla monocoltura. Inoltre, si vuole valutare l’espansione di cellule staminali mesenchimali quale fonte alternativa ai condrociti per la ricostruzione di cartilagine mediante bioreattore OPB tramite due tecniche differenti: coating superficiale di collagene delle camere del bioreattore OPB e microcarriers di collagene in sospensione nel bioreattore OPB. Materiali e metodi • Cocultura Per l’esperimento di co-cultura sono state isolate, da sei pazienti diversi (tutti dello stesso sesso per ridurre la variabilità dei risultati), tutti soggetti a protesizzazione d’anca sia cellule staminali mesenchimali che condrociti. I pazienti sono stati divisi in due gruppi in base alla loro età. Con le cellule di ciascun donatore è stata effettuata una coltura tridimensionale statica di tipo pellet, composta sia da una singola linea cellulare (100% condrociti e 100% BMSC), sia da una combinazione delle due (75%BMSC e 25% condrociti e 50%BMSC e 50% condrociti). Inoltre nella combinazione delle due linee cellulari, co-cultura, le cellule possono appartenere sia allo stesso donatore sia a donatori diversi, ma appartenenti sempre allo stesso gruppo I condrociti vengono espansi fino al secondo passaggio, mentre le cellule staminali mesenchimali fino al terzo passaggio. Viene utilizzata una densità cellulare di 4x10^5 cellule/pellet. Le cellule vengono messe in coltura con medium serum free ( DMEM con 1% di NaP, 1%di Hepes, 1% di PSG (Penicillin Streptomycin Gentamycin) e 1% ITS (Insulin Transferrin Selenium) a cui vengono aggiunti Desametasone ( 0,1µM), TGF β 1 (Transforming Growth Factor β 1) ( 10ng/ml), 0,1 mM di Acido Ascorbico e 0,4 mM di Prolina per 14 giorni all’interno dell’incubatore a 37°C, in condizioni di saturazione di vapore e 5% di CO2 con il tappo leggermente svitato. Alla fine della coltura viene valutata l’attività metabolica cellulare nelle diverse condizioni sperimentali tramite saggio Alamar Blue, viene quantificato il contenuto di DNA tramite il saggio CyQuant per vedere quale condizione di coltura induce una maggiore proliferazione cellulare. Inoltre viene eseguita un’analisi della quantità dei Glicosamminoglicani per valutare la potenzialità condrogenica delle cellule staminali nelle diverse condizioni sperimentali. • Coltura in OPB Un metodo di espansione cellulare valutato è stato il coating di collagene della camera dell’OPB. Per realizzare il coating di collagene della parete interna del tubo di silicone della camera sono stati effettuati test preliminari su dischetti di silicone. Per migliorare la condizione di adesione del coating di collagene sulla superficie del tubo in silicone e di rendere la sua superficie piu’ idrofilica e’ stata effettuata un’amminazione della superficie del tubo tramite protocollo flexicel. Per la preparazione del collagene è stata utilizzata una soluzione liquida di collagene da coda di ratto ( BD Bioscences) sia High che Low Concentration. È stato testato il coating del tubo in silicone e dei vetrini con una soluzione di collagene a tre diverse concentrazione ( 1mg/ml, 3 mg/ml e 5 mg/ml). Vengono seminate 10000 cellule/cm^2 sui dischetti di silicone e sui vetrini con coating di collagene e anche su dischetti di silicone senza coating come controllo. Le cellule vengono lasciate in coltura con terreno completo delle BMSC per una settimana. Alla fine della coltura viene fatta un‘analisi della vitalità cellulare tramite saggio Alamar Blue per vedere se le cellule si trovano in un ambiente favorevole all’interno del collagene e viene valutata la proliferazione cellulare all’interno del gel tramite saggio Cyquant. Per analizzare l’efficienza di recupero cellulare di cellule vitali dal gel sono state analizzate tre diverse condizioni di collagenase: 15 mg/ml per 15 minutie 5 mg/ml per 5 e 15 minuti. Viene effettuato anche il saggio LIVE/DEAD per analizzare la distribuzione cellulare all’interno del gel. L’altro metodo di espansione cellulare valutato è stata l’espansione delle cellule mesenchimali su microcarriers di collagene in sospensione nell’OPB. I microcarriers di collagene utilizzati in questo lavoro di tesi sono stati realizzati presso il Bioengineering Laboratories Spa (BEL). Vengono effettuati test di bagnabilità del supporto in mezzo di coltura, prove di degradazione in mezzo di coltura per Testare la resistenza del supporto stimando la degradazione dei microcarriers a 7 e 14 giorni. Si è valutata anche la degradazione enzimatica in soluzione di collagenase molto concentrata (15 mg/ml) per testare la possibilità di recuperare le cellule dai microcarriers. Volendo realizzare una coltura in bioreattore con microcarriers è stata realizzata una prova di galleggiabilità del materiale. È stata realizzata una camera ad hoc costituita da un connettore a finestra chiuso da una ghiera in acciaio con vetrino circolare, che ne permette una facile introduzione dei microcarriers tramite pipetta da laboratorio, ed un connettore, diametralmente opposto, di tipo luer-lock con una mesh metallica di 100µm per impedire la fuoriuscita dei microcarriers durante un eventuale cambio del terreno di coltura. I microcarriers dopo un precondizionamento in terreno di coltura vengono inseriti all’interno del bioreattore e si aggiungono 10 ml di medium. La velocità del bioreattore viene impostata a 1000 µm/s e l’oscillazione a 270°. Successivamente sono state realizzate prova di validazione cellulare del materiale sia con MG63, in quanto forniscono un’alta ripetibilità ed una buona riproducibilità degli esperimenti, sia con MSC perché maggiore rilevanti per le future applicazioni cliniche. Le prove di validazione sono state effettuate utilizzando dischetti di collagene su cui vengono seminate 15000 cellule. I tempi di controllo sono 24 e 48 ore. Per valutare la biocompatibilità dei microcarriers si effettua un ‘analisi della vitalità cellulare mediante Alamar Blue e per vedere se le cellule mesenchimali riescono a proliferare nel supporto di collagene viene eseguita una misura del contenuto di DNA mediante saggio CyQuant. Vengono utilizzati altri 9 dischetti seminati con cellule MG63 a 48, 72 e 168 ore per un’analisi qualitativa della morfologia cellulare tramite saggio MTT per vedere se le cellule penetrano e proliferano all’interno del dischetto, e se la loro distribuzione è uniforme. Una volta caratterizzato il materiale, è stato effettuato un esperimento di coltura dinamica con cellule staminali mesenchimali. Le densità cellulari valutate sono 40000 cellule/cm^2 e 10000 cellule/cm^2 a due diversi tempi di controllo, rispettivamente 5 e 9 giorni. La velocità di rotazione dell’OPB è di 1000µm/s e l’angolo di oscillazione di 270°. Alla fine di ogni esperimento viene effettuata un’analisi della vitalità cellulare e saggi per la stima della proliferazione e per l’efficienza di recupero delle cellule dai microcarriers. Viene inoltre eseguito il saggio LIVE/DEAD per valutare l’uniformità e la vitalità della distribuzione cellulare sui microcarriers e quanto le cellule penetrino al loro interno. Risultati  Cocultura Per ogni campione costituito dalla cocultura di condrociti e cellule staminali mesenchimali è stato calcolato il CI index, cioè l’indice di induzione condrogenica, al fine di valutare meglio eventuali miglioramenti nella vitalità cellulare, proliferazione e potenza condrogenica delle cellule staminali della cocultura rispetto alla monocultura. Se tale valore risulta maggiore di uno, allora l’induzione condrogenica è favorita, viceversa se risulta minore di uno. Dai risultati ottenuti dalla cocultura dopo 2 settimane non si rileva alcuna differenza statisticamente significativa (p>0,05) nei valori di vitalità tra cellule appartenenti allo stesso donatore o a donatori diversi sia per il primo che il secondo gruppo di pazienti. Per entrambi i gruppi i due diversi rapporti cellulari, 50%BMSC-50%AC e 75%BMSC-25%AC, presentano un trend simile tra loro. I valori di CI index per la proliferazione e la vitalità tra cellule appartenenti allo stesso paziente o a pazienti diversi sono abbastanza simili e superiori all’unità. In entrambi i gruppi il trend di potenza condrogenica per le combinazioni 75%BMSC-25%AC e 50%BMSC-50%AC è lo stesso. Ed i valori di CI index nei casi di cellule appartenenti allo stesso donatore o a donatori differenti risultano abbastanza simili, anche se in nessun caso tale valore supera l’unità.  Coltura in OPB Un sistema di coltura valutato per l’espansione delle cellule staminali mesenchimali in OPB è il coating superficiale di collagene della camera dell’OPB. Dalle prove di semina di cellule mesenchimali su coating di collagene del tubo di silicone per tre diverse concentrazioni di collagene (1mg/ml, 3 mg/ml e 5 mg/ml) e due diverse soluzioni madre, High Concentration e Low Concentration, si è visto che le cellule risultano vitali con valori abbastanza simili tra coating di collagene con soluzione madre low concentration e high concentration. Tra le diverse concentrazioni, i valori di vitalità risultano leggermente maggiori nel caso di coating di collagene con concentrazione 3mg/ml sia HC che LC. Le cellule staminali mesenchimali seminate sul tubo in silicone proliferano con livelli simili nel caso di coating di collagene del tubo di silicone con concentrazioni di 1mg/ml sia High Concentration che Low Concentration, anche se i valori sono leggermente inferiori alle concentrazioni 3 mg/ml HC e 5 mg/ml HC. Dalle immagini Live&Dead (vedi Figura 1) si può notare come le cellule risultino vitali e proliferino sul coating di collagene e nel caso con concentrazione di 1mg/ml ottenuta da soluzione madre Low Concentration le cellule sembrano assumere una distribuzione più uniforme rispetto alle concentrazioni. L’altro sistema di coltura per l’espansione delle cellule mesenchimali è rappresentato dai microcarriers di collagene in sospensione in OPB. Dalle prove di caratterizzazione si è visto che anche dopo due settimane in mezzo di coltura i microcarriers presentano ancora l’80% circa del loro peso iniziale e si degradano dopo 1 minuto in soluzione di collagenase I molto concentrata (15mg/ml) fino ad arrivare ad un 20 % del loro peso iniziale. Dopo il precondizionamento di 24 ore in medium di coltura i microcarriers, inseriti nel bioreattore ad una velocità di 1000µm/s con un’oscillazione di 270º presentano un comportamento disomogeneo. Una porzione variabile di microcarriers rimane sul fondo della cameretta durante la rotazione mentre l’altra porzione di microcarriers, costituita da microcarriers non completamente bagnati, tende a seguire la bolla d’aria e ad aderire alla parete della camera. Dalle prove di validazione cellulare del materiale effettuate con i dischetti di collagene si è visto che le cellule proliferino su tutto il dischetto e si distribuiscono in modo omogeneo sull’intera superficie, risultando essere dunque sufficientemente poroso per la migrazione cellulare (vedi Figura 2). Dopo la caratterizzazione del materiale è stata effettuata una coltura a 5 e 9 giorni in OPB di cellule staminali mesenchimali seminate a due diverse densità cellulari, 10000cellule/cm^2 e 40000cellule/cm^2. Le cellule seminate in questo supporto risultano vitali e proliferano maggiormente quando seminate ad una densità di 40000 cellule/cm^2. Discussione Dagli esperimenti di cocultura in un sistema di tipo pellet di condrociti e cellule staminali mesenchimali si è visto come non esista alcuna differenza in termini di vitalità cellulare, proliferazione e induzione condrogenica legata all’età del donatore e ai ai diversi rapporti cellulali, Tuttavia in alcuni casi i livelli di vitalità e di proliferazione cellulare sembrano essere maggiormente favorevoli nelle combinazioni con cellule isolate da pazienti diversi rispetto a quelle isolate dallo stesso paziente. Questo rappresenterebbe un vantaggio, in quanto si potrebbe risolvere il problema della disponibilità della fonte cellulare con un approccio basato sull’utilizzo di condrociti (o cellule staminali mesenchimali) eterologhi. L’uso di bioreattori permette di migliorare la qualità, riproducibilità, efficienza e uniformità del processo di semina rispetto ai metodi statici. (4) Inoltre permette di mantenere la concentrazione di gas e nutrienti desiderata nel terreno di coltura, facilitare il trasporto di massa attraverso il costrutto ed esporlo a stimoli fisici. In questa tesi si vorrebbero espandere cellule staminali mesenchimali all’interno del bioreattore OPB. Un approccio consiste nell’espansione su coating di collagene della parete interna della camera dell’OPB. In letteratura sono presenti studi in cui sono state seminate ed espanse cellule staminali su gel di collagene per la cartilagine cartilagine (5) ma anche per diverse applicazioni quali tendini (6), ossa (7) Le concentrazioni del gel di collagene utilizzate in letteratura per la coltura di cellule staminali mesenchimali sono 3mg/ml (8), 2,5mg/ml e 5 mg/ml (5) . Inquesto lavoro di tesi sono state coltivate cellule staminali mesenchimali per una settimana su tre diverse concentrazioni di gel di collagene 1 mg/ml, 3 mg/ml e 5 mg/ml partendo da due soluzioni madri differenti, high and low concentration. Analogamente allo studio effettuato da Deorsan (2010) (5) ,in cui però le cellule staminali erano state seminate su gel di collagene con concentrazione di 2,5 mg/ml e 3 mg/ml, le cellule risultano vitali e proliferano. Dalle immagini del Live&Dead risulta, comunque, che le cellule proliferino e aderiscano meglio al substrato nel caso di coating di silicone con un gel di collage di 1 mg/ml ottenuto da una soluzione madre low concentration. Investigando tre diverse condizioni di collagenase si è visto che la soluzione di collagenase a bassa concentrazione (5mg/ml) con un tempo di azione di 15 minuti permette di recuperare un maggior numero di cellule vitali. Quindi si possono facilmente recuperare le cellule dal supporto disgregando il gel senza danneggiare le cellule utilizzando una soluzione di collagenase meno concentrata. Un altro tipo di supporto per l’espansione cellulare valutato sono i microcarriers. In commercio esistono diversi tipi di microcarriers: porosi e non porosi, realizzati con collagene, gelatina, vetro. In letteratura sono presenti diversi studi che hanno dimostrano la possibilità di espandere cellule staminali mesenchimali seminate su Citodex, una matrice di destrano (9) (10), o su Cultispher-G (11) (12), di gelatina, e coltivate in spinner flask. In uno studio presente in letteratura è stata comparata la proliferazione ed il recupero cellulare da diversi tipi di microcarriers (cytodex 1, cytodex 3, collagene, hillex) dopo 5 giorni in bioreattore, mostrando come anche se i livelli di proliferazione maggiori si ottenevano nel caso di cellule mesenchimali staminali seminate su Citodex, si riusciva a recuperare un maggior numero di cellule vitali dai microcarriers di collagene. (13) A differenza, dunque, degli studi presenti in letteratura, in questo lavoro di tesi è stata valutata l’espansione cellulare in un nuovo tipo di microcarrier poroso di collagene in sospensione all’interno del bioreattore a perfusione oscillante. In quanto si è visto da uno studio di Goldstein et al. (2001), che comparando un bioreattore a perfusione con uno spinner flask, quello a perfusione si è dimostrato migliore per il trasporto del fluido. Infatti, utilizzando lo stessa velocità di flusso, lo stesso tipo di scaffold e la stessa densità cellulare il bioreattore a perfusione, rispetto allo spinner flask presentava una distribuzione cellulare più uniforme nello scaffold e cellule vitali in tutto il suo volume. (14) Dai risultati ottenuti si è visto i microcarriers di collagene anche dopo 2 settimane in mezzo di coltura continuano a mantenere l’80% del loro peso iniziale dimostrando perciò l’adeguatezza del supporto per tempi compatibili con l’espansione cellulare. Inoltre dopo 1 minuto in soluzione molto concentrata di collagenase si degradano rapidamente fino al 20% del loro peso iniziale, permettendo, quindi, un facile recupero cellulare dal supporto. Il materiale risulta inoltre sufficientemente poroso da permettere la migrazione e la proliferazione delle cellule in tutto il costrutto, con una distribuzione abbastanza uniforme. Come gli altri microcarriers porosi presenti in commercio, questo materiale permette di poter espandere un elevato numero di cellule al suo interno utilizzando un supporto di dimensioni ridotte. Le cellule seminate sui microcarriers e coltivate in bioreattore a 5 giorni presentano vitalità superiore rispetto alla coltura statica. Rispetto alla densità di 10000 cellule/cm^2, le cellule seminate alla densità di 40000 cellule/cm^2 proliferano maggiormente nel tempo. Conclusione La cocultura di condrociti e cellule staminali mesenchimali risulta più vantaggiosa della monocultura. Inoltre non esistono differenze le gate all’età del donatore. In alcuni casi la combinazione tra cellule di donatori differenti risulta migliore di quella con cellule dello stesso donatore. Si potrebbe dunque pensare ad un approccio con cellule eterologhe. Il coating di collagene del tubo di silicone per l’espansione delle cellule mesenchimali si presta bene come metodo di espansione cellulare, favorendo la vitalità e proliferazione cellulare soprattutto nel caso di coating con una concentrazione di 1mg/ml LC. Inoltre, permettono un facile recupero cellulare grazie alla facile disgregazione del materiale anche con una soluzione di collagenase meno concentrata. I microcarriers sono risultati dei materiali del resistenti per la coltura, porosi e facilmente degradabili in collagenase, permettendo un facile recupero cellulare. Si prestano bene come supporto per la coltura cellulare delle cellule mesenchimali staminali favorendone la vitalita e la proliferazione, soprattutto alla densità di 40000 cellule/cm^2 Bibliografia 1. Tuli R, Li WL, Tuan RS. Current state of cartilage tissue engineering. s.l. : Arthritis Res Ther, 2003. pp. 253-258. Vol. 5(5). 2. Hunziker EB. 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