Sviluppo e validazione sperimentale di un bioreattore per la rigenerazione del legamento crociato anteriore

The anterior cruciate ligament (ACL) is a connective tissue and its function consists on ensuring knee joint stability, providing restraint against anterior tibial translation and internal-external rotation during daily activity. The incidence of ACL injury is high and current strategies of reconstruction fail to restore long-term knee function and stability. Tissue engineering represents promising alternative compare to common therapies. The aim is to obtain in vitro engineered constructs as substitutes of injured or unhealthy tissues and organs. It could be achieve using appropriate cell source for the application, preferring autologous stem cells, and synthetic or biological scaffolds, whose morphology and mechanical properties may be similar to native tissue. Bioreactors are necessary to provide biochemical and physical stimulation for inducing cell growth, proliferation and differentiation and production of extracellular matrix (ECM). This thesis work was based on the optimization and on experimental validation of a bioreactor able to apply cyclic tensile force on silk fibroin scaffold seeded with rat’s mesenchymal stem cells (rMSCs). Electronic control system was programmed and working parameters was established with the purpose of in vitro reproducing of physiological ACL mechanical stimulation. Subsequently, bioreactor’s functionality was assessed and seeding technique was optimized to grant good cell adhesion on fiber silk matrix. The results obtained by experimental activity performed in the present thesis have shown that bioreactor is able to realize dynamic cell cultures for short time tests. It was demonstrated that experimental procedure by using bioreactor described in the present thesis work could be employed to perform long term tests, to assess the role of mechanical stimulation on cell behavior seeded on silk fibroin scaffold.

Il legamento crociato anteriore (LCA) è un tessuto connettivo la cui funzione consiste nel mantenere la stabilità dell’articolazione del ginocchio, limitando i movimenti di traslazione antero-posteriore e rotazione interna-esterna, durante la normale attività giornaliera. L’incidenza dei casi di lesione e rottura del LCA è estremamente elevata e le tecniche di ricostruzione chirurgica attualmente impiegate non conducono a risultati soddisfacenti, soprattutto nel lungo periodo. L’ingegneria dei tessuti offre una valida alternativa alle correnti terapie. Questa disciplina, infatti, si pone l’obiettivo di realizzare costrutti ingegnerizzati funzionali in vitro per sostituire organi o tessuti danneggiati in seguito a traumi o patologie. Per raggiungere tale scopo viene scelta una fonte cellulare appropriata per l’applicazione specifica, preferibilmente cellule staminali autologhe, e scaffold di origine sintetica o biologica, caratterizzati da morfologia e proprietà meccaniche analoghe al tessuto da sostituire. Inoltre, è previsto l’utilizzo di bioreattori, ovvero dispositivi in grado di fornire stimoli biochimici e fisici tali da indurre una risposta cellulare in termini di crescita, proliferazione e differenziazione e produzione di matrice extracellulare (ECM). L’obiettivo del presente lavoro di tesi consiste nell’ottimizzazione e nella validazione sperimentale di un bioreattore in grado di esercitare una sollecitazione ciclica a trazione su uno scaffold in fibroina della seta seminato con cellule staminali mesenchimali di ratto (rMSCs). Si è proceduto alla programmazione del sistema di controllo e all’impostazione dei parametri di funzionamento al fine di riprodurre il carico fisiologico a cui il legamento è soggetto in vivo. Successivamente, è stata verificata la funzionalità del bioreattore ed è stato ottimizzata la metodologia di semina per garantire una buona adesione delle cellule alle fibre dello scaffold. In conclusione dell’attività sperimentale svolta nella presente tesi, è stata dimostrata l’idoneità del bioreattore per lo svolgimento di colture cellulari in condizioni dinamiche controllate a tempi brevi di prova. La procedura di sperimentazione adottata mediante l’utilizzo del bioreattore impiegato nel presente lavoro di Tesi può essere, quindi, utilizzata per lo svolgimento di esperimenti di lunga durata, al fine di valutare il ruolo assunto dalla stimolazione meccanica sul comportamento delle cellule staminali mesenchimali seminate su uno scaffold in fibroina della seta.