Development of antibacterial surface modification treatments for titanium to improve the osteointegration

Titanium and titanium alloys have replaced over the years other commonly employed metals in different implantable devices and represent the first choice in hard tissue applications, especially for dental implants and join replacements. Due to the presence of a passive titanium oxide layer, titanium and titanium alloys possess optimal biocompatibility when implanted in the human body, but some surface modification technique are necessary to enhance specific biological properties to enhance their clinical performance. In particular, as regards bone contact applications, surface modifications are mainly needed to promote and speed up osseointegration process favoring osteoblast adhesion, proliferation and differentiation, increasing the anchoring to the bone and possibly improving the functional implant lifetime. Unfortunately one of the main serious complications related to implantable biomaterials is represented by the infection which leads, in many cases, to implant failure and need for revision, increasing also the social and health costs. One possible smart strategy to contrast the bacterial infection is to inhibit or avoid the microbial adhesion and/or to limit the bacteria proliferation. Aim of the work The aim of the work was to develop new biomimetic treatments for titanium and titanium alloys characterized by antibacterial properties maintaining high osteointegrative potential; more specifically the researched treatments had to prove cytotoxic effect for prokaryotic cell without any adverse effect on eukaryotic cell and on the mineralization process. The technique chosen to reach this goal was Anodic Spark Deposition (ASD), an electrochemical technique which allows to homogeneously modify titanium oxide surfaces characterized by microporous and nanorough topography with a modified surface chemical composition enriched by the elements present in the treatment electrolytic solution. Silver and gallium compounds were considered as antimicrobial agents, whose are known for their bactericidal properties and for the absence of bacterial resistance, while Ca, P, Si and Na were considered for their bone affinity. By ASD, titanium oxide was properly enriched with different chemical elements to provide antibacterial effect while, at the same time, to improve osseointegration. Among many developed different ASD electrolytic solutions, four of them were particularly studied (AgCis, GaOss, GaCis and AgNPs): electrical variables were researched to properly modify chemical and physical properties of the obtained oxide films. Untreated titanium and a previously developed osteointegrative ASD coating nowadays used in clinical practice in dental field (called SiB-Na) were used as controls. Characterization of the developed coatings The physical characterization of the developed materials was performed using SEM, TF-XRD, laser profilometry (LP), optical contact angle measurements (OCA). The chemical properties of the developed coatings were analyzed using EDS, XPS and GDOES. Additionally the antibacterial agents release from the coating was quantified with ICP-OES up to 21 days. The mechanical characterization of the developed materials was performed using micro indentation to define the hardness and the elastic modulus while scratch test and delamination test were considered to analize the coatings adhesion. The direct cytocompatibility of the coating was investigated with osteoblast Saos2 cell line up to 21 days and primary human gingival fibroblasts (HGFs) up to 7 days. The cell viability was studied respectively with Alamar Blue assay and MTT assay, while cell morphology and spreading was investigated by SEM and from the actin and tubulin staining (for Saos2). Additional Alkaline Phosphatase (ALP) production of Saos2 cell was quantified after 21 days of cells culture on samples. The indirect cytotoxicity was evaluated using Saos2 cell cultured with the supernatants conditioned up to 21days, on primary human gingival fibroblasts (HGFs) and periodontal ligament fibroblasts (hPDLs). Antimicrobial characterization was performed on both gram positive and gram negative bacteria strains: S.epidermidis, S.mutans and E.coli which are commonly related to implant-associated infections. In particular the bacteria viability after 3h and 24h of incubation was studied and the anti-adhesion properties of the coating was investigated after 3h of incubation in bacterial solution. Moreover, the antibacterial activity of the coatings was also assessed on the samples after 21 days of antibacterial agent release in D-PBS to test the long-lasting antibacterial activity. Finally the S.mutans, S.epidermidis and A. baumannii (an operating theatre weeds agent) biofilm formation was investigated after 24 and 72h of incubation. Results The ASD biomimetic treatments developed allowed to obtain stable, reproducible, and homogeneous coatings characterized by microrough and porous topography with a completely modified surface chemistry capable to stimulate the osteointegration process and to possess, at the same time, antibacterial activity on both gram positive and gram negative bacteria strains: these treatments were found effective against bacteria adhesion and bacteria proliferation. Furthermore they interfere with the biofilm formation in all of the bacterial biofilm producer strains investigated. Finally the experimented coatings showed a long-lasting antibacterial activity, probably due to the stable presence of the antibacterial agents in the oxide layer.

Il titanio e le leghe di titanio hanno sostituito nel corso degli anni gli altri metalli comunemente impiegati in diversi dispositivi impiantabili e rappresentano la scelta d’elezione nelle applicazioni che coinvolgono i tessuti duri, in special modo per l’implantologia odontoiatrica e per le sostituzioni articolari ortopediche. Grazie alla presenza di strato passivante di ossido di titanio, il titanio e le sue leghe mostrano ottima biocompatibilità una volta impiantati; tuttavia vengono spesso utilizzate delle tecniche di modifica superficiale per migliorarne le proprietà biologiche e la conseguente prestazione clinica. In particolare, per quanto riguarda le applicazioni a contatto con il tessuto osseo, le modifiche superficiali sono adottate al fine di promuovere e accelerare il processo di osteointegrazione favorendo l'adesione, la proliferazione e il differenziamento delle cellule osteoblastiche, aumentando così l'ancoraggio all'osso e possibilmente migliorando la durata funzionale dell'impianto. L’insorgenza delle infezioni rappresenta una delle complicanze maggiori legate all’utilizzo di biomateriali impiantabili portando, in molti casi, al fallimento dell'impianto stesso con conseguente necessità di una revisione, con conseguente aumento di costi sociali e sanitari correlati. Una possibile strategia per contrastare l'infezione batterica è di limitare o evitare l'adesione batterica così come la proliferazione. Lo scopo del lavoro è stato quello di sviluppare nuovi trattamenti biomimetici per titanio e leghe di titanio, caratterizzati da proprietà antibatteriche mantenendo nel contempo un alto il potenziale osteointegrativo. Per lo sviluppo dei trattamenti è stata utilizzata una tecnica elettrochimica nota come Anodic Spark Deposition (ASD), che permette di modificare omogeneamente la topografia delle superfici in titanio che risultano caratterizzati da topografia microporosa e nanorugosa con una composizione chimica arricchita dagli elementi presenti nella soluzione elettrolitica. Come agenti antibatterici sono stati utilizzati sali di argento e di gallio dalle note proprietà battericide, mentre il Ca, P, Si e Na sono stati utilizzati quali elementi utili per la stimolare l’osteointegrazione. Tra le soluzioni elettrolitiche ASD sviluppate, quattro di esse sono state completamente caratterizzate (AgCis, GaOss, GaCis e AgNPs) utilizzando il titanio non trattato e il trattamento SiB-Na come trattamenti di controllo. Quest’ultimo trattamento è stato precedentemente sviluppato ed è oggi utilizzato nella pratica clinica in campo odontoiatrico. La caratterizzazione fisica dei materiali sviluppati è stata eseguita usando SEM, TF-XRD, profilometria laser (LP), e misure di angolo di contatto statico e dimamico. Le proprietà chimiche dei rivestimenti sviluppati sono stati analizzate utilizzando EDS, XPS e GDOES. Il rilascio degli agenti antibatterici è stato studiato fino a 21 giorni e quantificato con ICP-OES. Le proprietà meccaniche dei rivestimenti sono state studiate tramite microindentazione per l’analisi della durezza e del modulo elastico, mentre l'adesione dei rivestimenti è stata studiata tramite scratch test e prove di bending. La citocompatibilità diretta dei rivestimenti è stata studiata con cellule di linea osteoblastica Saos2 e fibroblasti gengivali primari umani (hgfs) rispettivamente con saggio Alamar Blu e saggio MTT, mentre la morfologia cellulare è stata studiata mediante SEM ed immuinoistochimica. Inoltre è stata valutata la produzione di fosfatasi alcalina (ALP) da parte delle cellule osteoblastiche. La citotossicità indiretta è stata valutata utilizzando cellule Saos2, fibroblasti umani primari gengivali (hgfs) e fibroblasti del legamento parodontale (hPDLs). La caratterizzazione microbiologica è stata effettuata analizzando ceppi batterici gram positivi e gram negativi comunemente correlati ad infezioni su dispositivi impiantabili: S.epidermidis, S.mutans E.coli. In particolare sono state valutate l’adesione e la la vitalità batterica dopo 3h e 24 ore di incubazione in soluzione batterica. L'attività antibatterica a lungo termine dei trattamenti è stata inoltre valutata su campioni dopo 21 giorni di rilascio dell’agente antibatterico in D-PBS . Infine è stata valutata la capacità dei trattamenti di inibire la produzione di biofilm da parte dei ceppi batterici di S.mutans, S.epidermidis e A. baumannii . I trattamenti ASD biomimetici sviluppati hanno permesso di ottenere rivestimenti stabili, riproducibili e omogenei caratterizzato da una topografia microporosa e nanoporoso con una chimica di superficie completamente modificata in grado di stimolare il processo di osteointegrazione e possedere al tempo stesso attività antibatterica sia nei confronti di ceppi gram positivi che gram negativi: questi trattamenti si sono dimostrati efficaci nel limitare l’adesione e la proliferazione batterica. Inoltre essi interferiscono con la formazione di biofilm in tutti i ceppi batterici indagati. Infine i rivestimenti sviluppati hanno mostrato una attività antibatterica a lungo termine, a causa della presenza stabile degli agenti antibatterici nello strato di ossido.