Products and materials from biological sources : isolation, analysis and chemical reactivity

The PhD project deals with physical and chemical elaboration of biological materials and their analysis. The aim was to obtain new or alternative valuable products to be used in different field, i.e. pharmaceutical, specialty chemicals and polymers. Different broad area were covered from oligosaccharides functionalization to natural polyisoprene recovery and chemical modification, to chiral ionic liquid synthesis to be used in separation analysis. More specifically, the activity was designed along three different topics: 1. Synthesis of antimetastatic sulfated oligosaccharide mimics (First year activity). The aim of this part of the research is the synthesis of a novel potential heparanase inhibitor, an enzyme playing a role in tumor progression and metastatic potential. We have focused on polysulfated carbohydrate-derived inhibitors. In the present work, we have applied an electrochemical approach to the synthesis of acetylated C-C hexasaccharide-like-mimics starting from per-acetyl-1-bromo-maltotriose (1-ABMT) which was dimerized by means of an electoreduction step in acetonitrile at a silver cathode. During this step three different per-acetylated diastereoisomers can be obtained according to the anomeric configuration: alpha,alpha, alpha,beta and beta,beta. Trough HPLC analysis it has been possible to determine the ratio of the different diastereoisomers, indicating that products form in a statistical distribution (1:2:1). These data strongly support a radical mechanism for the reaction. To separate the diastereoisomers, a first enrichment step with flash chromatography, followed by a semipreparative HPLC step were necessary. Furthermore, such compounds were deprotected, sulfated and fully characterized by NMR. The resulting compounds were tested for antimetastatic properties and compared with sulfated maltohexaose (MHS) and some representative glycosides. In conclusion, a versatile electrochemical method for obtaining C-C oligosaccharide-like mimics has been developed via the peracetylated substrate. The C-C hexasaccharide diastereosomers were established as glycomimetics of the heparanase inhibitor MHS. The comparison of antimetastatic activity in lung cancer show that the C-C hexasaccharide are more active with respect the C-O-C analogue and in particular between the two diastereoisomers the α,α was the most active. 2. Isolation and modification of polyisoprene from alternative crops (Second-third year activity) Natural rubber (NR) is a unique biopolymer because it is a strategic raw material used in more than 40,000 products and in many of its most significant applications, cannot be replaced by synthetic alternatives. The main source of NR is Hevea brasiliensis, a tree native of Brazil. To look for alternative sources of natural rubber appears nowadays to have a strategic importance, in the light of the foreseen shortages in NR supply from Hevea brasiliensis. In particular we focused our attention on Parthenium argentatum (also known as Guayule) that is a flowering shrub already used in the early 20th century as a commercial alternative source of natural rubber. The main difference between Hevea brasiliensis and Guayule is the location of latex in plants and the content of proteins and terpenes and these differences strongly affect the choice of the extraction and purification method. Therefore we targeted our efforts on development of potential industrial approaches to isolate and purify polyisoprene, especially from Guayule latex. Four different approaches were used to isolate polyisoprene: 1) evaporation, 2) ultracentrifugation, 3) precipitation and extraction with solvent, 4) extraction with ionic liquids (IL). The first two methods are useful to fully characterize and then use by products isolated from latexes to understand their influence on Guayule Rubber (GNR) performance in items (mainly tyres). Both components of latexes derived from Guayule, polymeric and low molecular components, were characterized by means of different analytical technique such as: 1H- and 13C-NMR, DSC, TGA, GC-MS, ATR FT-IR spectroscopy, elementary analysis and qualitative ICP-OES. It’s results that Guayule polyisoprene have thermal behaviour and structure very close to the Hevea’s one. On the contrary, content and distribution of low molecular weight components and proteins are very different. From Guayule latex were isolated significant amount of mono- and sesqui-terpenes (i.e. cinnamate and anisate esthers of germacrene alcohol named guayulin A and B, respectively) and several steroids (i.e. argentatin). The methods 3 and 4 were developed to obtain the cleanest as possible polyisoprene from Guayule. With the third method, the solvent for precipitation was acetone and the extraction solvent was ethyl acetate. The third method afforded clean GNR using acetone to precipitate rubber and ethyl acetate to clean it. This method has the handicap to use large amounts of solvents. So the last method used IL to extract rubber from Guayule latex to use the ability of some particular ionic liquid (imidazolium salts) to disrupt cell walls (dissolving cellulose and lignin). The main advantage of the use of IL is that this method can be applied both on latexes and whole plants, allowing to recover a larger amount of components from plant and at the same time minimizing the amount of waste solvents produced. Efficient coagulation of Guayule latex with remarkable decrease of proteins and polysaccharides was obtained at 25°C by use of 1-buthyl-3-methyl imidazolium tetrafluoroborate followed by washing with acetone. Recovering of GNR from IL and recycling of IL was investigated. In conclusion NR from Guayule has suitable molecular features to replace NR from Hevea brasiliensis but the different distribution of other latex components provides a different spectrum of applications. The developed extraction methods investigated have clarified the opportunities and limits of the purification of GNR and side products recovery, suggesting alternative processes for industrial methods to obtain rubber from Guayule latex. The performance of extracted GNR was evaluated by stress relaxation and mechanical testing (in collaboration with Pirelli Tyre S.p.A. analytical laboratory) on starting and vulcanized rubber under standard conditions, identifying the role of by-products and purification procedure. In addition, we have explored possibilities to prepare oligomeric products from NR by oxidative chains breaking and derivatization of GNR and NR by epoxidation with dimethyldioxyrane. Double bond breaking reactions with oxygen and other peroxide was carried out to provide telechelic oligomers. 3. Synthesis of chiral ionic liquid for separation applications (Stage at QUILL Laboratory) I joined the QUILL (Queen’s University Ionic Liquid Laboratory) the world expert on ionic liquid as a visiting student for a period of three months. During this period I worked under the supervision of Dr. Martin Earle on the synthesis of chiral ionic liquids (IL) to be tested in Ionic Liquid-Liquid Chromatography (ILLC). This chromatography technique is based on the fact that ionic liquids (IL) may form biphasic liquid systems with numerous solvents, including water, which makes them possible candidates in counter-current chromatography (CCC). In particular were synthesized two different kind of chiral IL to be tested on ILLC machine used in QUILL, which is based on the Ito design, but has been extensively modified to handle ionic liquids. The first was 1-ethyl-3-methyl imidazolium camphor-10-sulfonate (EMIM CS), already prepared at QUILL but it was not already tested on ILLC. It was prepared in large amount starting from 1-ethyl-3-methylimidazolium chloride (EMIM Cl) and commercially available camphor-10-sulfonic acid (CSA). It was tested on ILLC with biphasic system made up of IL/EtOAc and IL/H2O/EtOAc in different percentage to set all parameters of the system. Results indicate that the biphasic system made of EMIM CS/H2O/EtOAc is potentially suitable for chiral separation in ILLC. Meanwhile it was arranged the synthesis of an additional potential chiral ionic liquid starting from proline to give diastereomeric mixture of (2S)-1-benzyl-2-(isopropoxycarbonyl)-1-methylpyrrolidi-1-ium-bromide but it wasn’t yet tested on ILLC because the separation of the distereoisomers salts is still under optimization.

Il progetto di dottorato ha trattato l’elaborazione fisica e chimica di materiali biologici e la loro analisi. L’obbiettivo era quello di ottenere prodotti di valore nuovi o alternativi da utilizzare in diversi campi, per es. farmaceutico, specialità chimiche e polimeri. Sono state coperte diverse ampie aree, dalla funzionalizzazione di oligosaccaridi, al recupero del poliisoprene e la sua modifica, alla sintesi di liquidi ionici chirali da utilizzare in tecniche di separazione. Più specificatamente l’attività è stata suddivisa in tre argomenti differenti: 1. Sintesi di oligosacccaridi solfati mimetici con attività antimestatica (attività del primo anno) L’obiettivo di questa parte della ricerca è stata la sintesi di un nuovo potenziale inbitore dell’heparanase, un enzima che è coinvolto nella progressione dei tumori e del potenziale metastatico. Abbiamo focalizzato la nostra attenzione su inibitori polisolfati derivati da carboidrati. Nel presente lavoro, abbiamo applicato un approccio elettrochimico alla sintesi di mimetici C-C di esaccaridi acetilati partendo dal per-acetil-1-bromo-maltotriosio (1-ABMT) che è stato dimerizzato mediante riduzione elettrochimica ad un catodo d’argento in acetonitrile. Durante questo step vengono ottenuti tre diversi diastereoisomeri per-acetilati a seconda della configurazione anomerica: alfa,alfa, alfa,beta and beta,beta. Attraverso l’analisi HPLC è stato possibile determinare il rapporto dei tre diastereoisomeri indicando che i prodotti si formano con una distribuzione statistica (1:2:1), dato che supporta fortemente un meccanismo di tipo radicalico per la reazione. Per separare i tre diastereosimeri è stato necessario eseguire un primo arricchimento mediante flash chromatography, seguito dalla purificazione con HPLC semipeparativo. Inoltre questi composti sono stati deprotetti, solfatati e caratterizzati completamente mediante NMR. Dei composti risultanti è stata testata l’attività antimetastatica e sono quindi stati confrontati con il maltoesaosio solfato (MHS) e altri glicosidi rappresentativi. In concluione, è stato sviluppato, a partire da un substrato peracetilato, un versatile metodo elettrochimico per ottenere mimetici C-C di oligosaccaridi. I diastereosomeri esaccaridici C-C sono stati riconosciuti come glicomimetici dell’inibitore dell’heparanase MHS. Il confronto dell’attività antimetastatica nel cancro ai polmoni mostra che gli esasaccaridi C-C risultano più attivi rispetto agli analoghi C-O-C e in particolare, tra i due diastereosomeri testati, l’ α,α risulta essere il più attivo. 2. Isolamento e modifica del poliisoprene da colture alternative (attività del secondo e terzo anno) La gomma naturale (NR) è un biopolimero unico perchè è un materiale di partenza strategico usato in più di 40,000 prodotti e che in molte delle sue applicazioni, non può essere sostitutito da alternative sintetiche. La principale fonte di NR è l’Hevea brasiliensis, un albero nativo del Brasile. Oggi la ricerca di fonti alternative della gomma naturale, appare di importanza strategica, alla luce della predetta mancanza di disponibilità di NR da Hevea brasiliensis. In particolare abbiamo focalizzato la nostra attenzione sul Parthenium argentatum (anche conosciuto come Guayule) che è un cespuglio in fiore, già utilizzato all’inizio del ventesimo secolo come fonte commerciale alternativa di gomma natirale. La principale differenza tra Hevea brasiliensis e Guayule è il diverso posizionamento del lattice nelle piante e il diverso contenuto di proteine e terpeni che influenza la scelta dei metodi di estrazione e purificazione. Quindi abbiamo focalizzato i nostri sforzi sullo sviluppo di potenziali approcci industriali per isolare e purificare il poliisoprene, specialmente dal lattice di Guayule. Sono stati usati quattro diversi approcci per isolare il poliisoprene: 1) evaporazione, 2) ultracentrifugazione, 3) precipitazione ed estrazione con solvent, 4) estrazione con liquidi ionici (IL). I primi due metodi sono utili per caratterizzare completamente e quindi utilizzare i sottoprodotti isolati dal lattice anche per comprendere la loro influenza sulle prestazioni negli articoli (principalmente pneumatici) della gomma Guayule (GNR). Sono stati caratterizzati entrambi i componenti derivati dal lattice di Guayule, sia i componenti a basso peso molecolare sia la componente polimerica, mediante varie tecniche analaitiche come: 1H- e 13C-NMR, DSC, TGA, GC-MS, spettroscopia ATR FT-IR, analisi elementare e ICP-OES qualitativo. Si deduce che il poliisoprene da Guayule, ha lo stesso comportamento termico e struttura molto simile a quello da Hevea brasiliensis. Dal lattice di Guayule sono state isolate significative quantità di mono- e sesqui-terpeni (es. esteri cinnamici e anisati dell’alcol germacrene chiamati rispettivamente guayulin A e B) e parecchi composti della famiglia delgi steroidi (es. argentatine). I metodi 3 e 4 sono stati sviluppati per ottenere poliisoprene più pulito possibile da Guayule. Nel terzo metodo il solvente di precipitazione è stato acetone e quello di estrazione è stato acetato di etile. Questo metodo ha prodotto GNR pulita ma con lo svantaggio di utilizzare una grande quantità di solventi. Quindi nell’ultimo metodo è stata sfruttata la capacità di alcuni particolari IL (sali di imidazolo) di rompere le pareti celluari (solubilizzando cellulosa e lignina) per estrarre la gomma dal lattice di Guayule. Il principale vantaggio di utilizzare IL è che questo metodo può potenzialmente essere applicato sia al lattice sia all’intera pianta, permenttendo di recuparere una maggiore quantità di componenti dalla pianta e allo stesso tempo di minimizzare la quantità di solventi prodotta nel processo. E’ stata ottenuta una efficente coagulazione del lattice di Guayule con una notevole diminuzione delle proteine e dei polisaccaridi a 25 °C utilizzando 1-buthyl-3-methyl imidazolium tetrafluoroborate seguito da un lavaggio con acetone. E’ stato studiato il recupero della GNR e la possibilità di riciclare il liquido ionico. In conclusione NR da Guayule ha idonee caratteristiche molecolari per sostituire quella da Hevea brasiliensis, ma la differente distribuzione degli altri componenti del lattice fornisce un diverso spettro di applicazioni. I metodi di estrazione sviluppati hanno chiarito le opportunità e i limiti della purificazione della GNR e del recupero dei sotto prodotti, suggerendo porcessi alternativi per l’ottenimento industriale della gomma dal lattice di Guayule. Le prestazioni della GNR estratta sono state valutate mediante esperimenti di stress relaxation e test meccanici (eseguiti in collaborazione con i laboratori analitici di Pirelli Tyre S.p.A.) sulla gomma di partenza e su quella vulcanizzata in condizioni standard, identificando il ruolo dei sottoprodotti e della procedura di purificazione. In più, abbiamo esplorato la possibilità di preparare prodotti oligomerici da NR mediante rottura ossidativa della catene e derivatizzazione di GNR e NR mediante epossidazione con dimetildiossirano. Le reazioni di rottura del doppio legame sono stati ottenute mediante l’utilizzo di ossigeno e altri perossidi a dare oligomeri telechelici. 3. Sintesi di liquidi ionici chirali per applicazioni in tecniche di separazione (attività svolta al QUILL) Ho frequentato il QUILL (Queen’s University Ionic Liquid Laboratory), che è tra gli esperti mondiali nel campo dei liquidi ionici, per un period di tre mesi. Durante questo periodo ho lavorato sotto la supervisione del Dr. Martin Earle sulla sintesi di liquidi ionici chirali da testare nella Ionic Liquid-Liquid chromatography (ILLC). Questa tecnica cromatografica è basata sul fatto che i liquidi ionici possono formare sistemi liquidi bifasici con molti solventi, inclusa l’acqua, rendendoli buoni candidati nella counter-current chromatography (CCC). In particolare sono stati sintetizzati due diversi tipi di IL da testare nella macchina ILLC usata al QUILL, che è basata sul design di Ito, ma che è stata opportunemente modificata per maneggiare i liquidi ionici. Il primo IL sinteizzato è stato 1-ethyl-3-methyl imidazolium camphor-10-sulfonate (EMIM CS), già preparato al QUILL ma non ancora testato in ILLC: E’ stato preparato in grande quantità partendo dal 1-ethyl-3-methylimidazolium chloride (EMIM Cl) e dal camphor-10-sulfonic acid (CSA) composto commercialmente disponibilie. Questo liquido ionico è stato testato in ILLC con sistemi bifasici costituiti da IL/EtOAc e IL/H2O/EtOAc in diverse percentuali per fissare tutti i parametri del sistema. I risultati indicano che il sistema bifasico composto da EMIM CS/H2O/EtOAc è potenzialmente adatto per operare separazioni chirali con ILLC. Nel frattempo è stata organizzata la sintesi di un altro potenziale liquido ionico chirale, partendo dalla prolina a dare una miscela diastereosimerica di (2S)-1-benzyl-2-(isopropoxycarbonyl)-1-methylpyrrolidi-1-ium-bromide che però non è stato ancora testato in ILLC perchè la separazione dei sali diastereoisomeri deve ancora essere ottimizzata.