Mechanical characterization of amyloid proteins on a nanoscale

Amyloid proteins have been attracting increasing interest in the last years due to their remarkable mechanical properties. This kind of biological material is composed of stacks of β sheet proteins that assemble to give fibrils which, in turn, aggregate to give the final mature fibers. These fibers, in gram-negative Enterobacteriaceae, are called curli and are used during the colonization of surfaces, in the formation of biofilm. In this work, mechanical characterization of curli amyloid fibers has been conducted. Two techniques were used to assess the mechanical properties, named “Nano-direct” and “Nano-indirect”, respectively. The first is based on a nano 3-point bending test performed with an atomic force microscope (AFM) tip. The solution containing the fibers was deposited on a silicon substrate on which some grooves had been made with a focus ion beam (FIB) technology. The fibers were then imaged in contact mode and the ones that were bridging the grooves were pressed. From the elaboration of the force-deflection curves, the Young´s modulus was obtained. The “Nano-indirect” technique is based on thermal fluctuations. Basically, measuring the curvature of a fiber from transmission electron microscope (TEM) images, it is possible to calculate its Young´s modulus. Since the second of the methods described is easier to perform, it was preliminarily validated, measuring the Young´s modulus with both methods for the same kind of fibers. The equivalence of the two methods was confirmed by a Mann-Whitney statistical test. After this, fibers obtained from different genetic sequences and at different maturation stages were compared, using the “Nano-indirect” method only. The outcome of this work is a substantial independence of the value of Young´s modulus from the different gene sequences tested. On the other hand, the value of Young´s modulus does changes between pristine fibers and mature ones, increasing its value by roughly one order of magnitude.

La presente tesi tratta la caratterizzazione meccanica di fibre proteiche amiloidi. Tali fibre, in generale, sono costituite da sequenze di foglietti β impilati gli uni sugli altri. Esse sono state studiate negli ultimi anni e le loro proprietà meccaniche sono molto promettenti: le amiloidi hanno infatti, almeno su scala nanometrica, un modulo di Young relativamente alto se confrontato con altri materiali di derivazione biologica, e allíncirca pari a quello della seta, già nota per le sue proprietà di rigidezza e tenacità. In questo progetto, si vuole verificare se anche le fibre curli, derivate da espressione genica nell´enterobatterio gram negativo E. Coli, presentano valori di modulo simili ad altri tipi di amiloidi, con l’obiettivo ultimo di verificare la possibilità di un loro utilizzo in eventuali dispositivi, almeno su scala nanometrica. Inoltre, dato che queste fibre sono ottenute tramite ingegneria genetica e questo ha permesso di controllare la loro composizione in maniera pressoché completa, si é voluto verificare in questo lavoro se e come il modulo di Young vari a seconda di come le fibre sono ottenute e del loro stadio di maturazione. Queste fibre infatti sono già naturalmente prodotte da E. Coli durante la formazione di biofilm. Le fibre, di dimensioni nanometriche, sono state caratterizzate seguendo due diversi metodi definiti rispettivamente “Nano-direct” e “Nano-indirect”. Il metodo “Nano-direct” consiste nell’effettuazione di test di flessione a tre punti su scala nanometrica. Le fibre sono state depositate su un substrato di silicio sul quale sono stati precedentemente creati dei solchi tramite tecnologia focused ion beam (FIB). Una volta identificata una fibra a cavallo di un solco tramite contact mode imaging, esse è stata sottoposta ad una sollecitazione in flessione, utilizzando la punta di un microscopio a forza atomica (AFM). Misurando la forza e lo spostamento é stato ottenenuto il modulo di Young. Il metodo “Nano-indirect” si basa invece sulla misura delle fluttuazioni termiche delle fibre, ottenuta elaborando le micrografie ottenute con un microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Dall’analisi della curvatura della fibra è possibile risalire al modulo di Young del materiale. Siccome il metodo “Nano-indirect” é di più agevole sviluppo, si sono anzitutto validati i suoi risultati confrontandoli con quelli ottenuti con il metodo “Nano-direct” effettuato sullo stesso tipo di fibra. Una volta effettuata con successo la validazione, si è proceduto alla caratterizzazione delle fibre con diverse sequenze geniche o diversi gradi di maturazione utilizzando il solo “Nano-indirect”. Sia la validazione sia i confronti fra le fibre sono stai effettuati tramite un test statistico di tipo Mann-Whitney. É stata ottenuta una sostanziale indipendena del volere del modulo rispetto alle diverese sequenze geniche considerate, mentre pare che il grado di maturazione delle fibre influisca sul questa grandezza. Si sono infatti registrati incrementi di circa un ordine di grandezza passando da fibre “pristine” a fibre “mature”.