Progettazione e sviluppo di uno strumento per estrazione di materiale genomico basato su lab-on-chip

Genomics is a branch of molecular biology, which involves the study of the structure, contents and evolution of genomes. Over the last thirty years we have seen a huge growth of knowledge in the field of genomics. The recognition and analysis of nucleotide sequences of DNA (deoxyribonucleic acid) and information related to them, have found applications in many areas, from research in the field of biology, the clinical setting, the diagnostic, the pharmaceutical, food and even forensic. DNA analysis can be seen as a set of procedural steps which begins with the preparation and extraction of the DNA from the sample, followed by its quantification, amplification and sequencing. During each of these phases issues may arise, but the extraction phase is known to have a large effect on the correctness of the result from the analysis. This phase in fact has the purpose of releasing the DNA contained in the nucleus of each cell and, to purify it from the proteins that make it impure and may interfere with subsequent analysis. The importance of having a high quality sample of purified DNA cannot be underestimated. The extraction of DNA is performed in biological laboratories using manual techniques that require the use of test tubes, large amounts of reagents and laboratory centrifuges. Because of encumbrance of the instrumentation and the necessity to have qualified personnel, the process of extraction of nucleic acids remains confined within a biological laboratory. Given the growing request for point-of-care equipment to analyze the DNA, also the techniques of nucleic acid extraction will have to go in the same direction. The idea of the point-of-care is to use tools: automatic, compact, accurate and affordable which can also be used by unskilled personnel. A strong push towards the reduction of the dimensions of these systems has been provided by the development of MEMS technology (Micro Electro-Mechanical Systems).A MEMS device is a highly miniaturized system, that integrates electronics, electrical and mechanical devices on the same silicon substrate. All components of a MEMS device, even those not strictly electronic, are produced using standard processes for the production of integrated circuits. The combination of this technology with the latest field of microfluidics, which deals with the handling and transport of small quantities of liquids, led to the birth of new devices called Lab-On-Chip (LOC). These devices integrate multiple functions, similar to those performed in the laboratory on a chip with dimensions between the millimeter and centimeter square. In Lab-On-Chip, due to the large surface to volume ratio, surface effects such as electrostatics and wettability dominate on the volume effects such as inertia or thermal mass. Compared to conventional biochemical analysis systems, the Lab-On-Chip offer many advantages such as portability, reduction of the volume of the reagents, the automation, the mass production, decrease of the analysis times, high throughput and low power consumption of energy. The integration of the whole process of extraction of nucleic acids on a microfluidic device would allow to automate the entire process, to reduce the consumption of reagents and avoid the use encumbrance laboratory instruments. While a great deal of attention has been placed on to the development of new technologies for genomic analysis on Lab-On-Chip, the development of automated systems for the extraction of nucleic acids, based on the same technology has been limited. These limitations also have an impact on the portability of nucleic acid amplification systems based on Lab-On-Chip. These systems require a DNA sample already purified as input. The goal of this thesis is the design and development of a compact system for the extraction of genomic material realized on Lab-On-Chip, that integrates within it all the chemical and electronic components necessary for the extraction process. The extracted DNA with the developed system may be used by systems for genomic analysis system (Point-of-Care). The report of the thesis is divided into 6 chapters. The first chapter, gives an overview of the structure of nucleic acids and on the techniques used in biology laboratories to extract nucleic acids. The second chapter gives an overview on the microfluidics, by analyzing the behavior of fluids, when they are manipulated into channels of hundreds of micrometers. We will also discusses the key components that compose a microfluidic system. The third chapter provides a detailed description of all components of the developed system for the extraction of nucleic acids. For the electronic components will be illustrated conditioning circuits, while for the mechanical components will be explained the characteristics of the electronic circuits and their interfacing that allow the control. Through the use of block diagrams will be highlighted the connections between the individual components and the control board of the system. In this chapter also discusses the algorithm used to calibrate an optical sensor, which allows to assess the state of filling of the fluid circuit of the system. It will also illustrate the algorithm that manages the timing of the magnetic arm that allows the agitation of magnetic beads. Finally will be described the solution adopted to detect the position of the motor. The fourth chapter contains all the algorithms and technical solutions to efficiently control the piezoelectric micropump. Will be explained the process to obtain a square wave with high voltage, starting from 12 volts with which the system is powered. Will be explained in detail the operation of the PID controller and how the polynomial’s coefficients are calculated. This polynomial allows to the PID algorithm to estimate the voltage that supplies the micropump. Finally will be illustrated the technical solutions adopted in order to generate different signals to supply the micropump. The fifth chapter describes the results achieved by each component of the system designed. Will be illustrated the trend of the supply voltage of the micropump at the change of the value of coefficients of the PID controller. It will be present the results obtained from the fluidic and sound characterization of the micropump using different power signals. It will be illustrated the three-dimensional model of the developed system. In conclusion, we comment the results of the validation of the instrument through the use of amplification techniques. The sixth chapter shows the results obtained by the system developed in this thesis and proposes some future improvements.

La genomica è una branca della biologia molecolare che si occupa dello studio della struttura, del contenuto e dell'evoluzione dei genomi. Nell'arco degli ultimi trent'anni si è assistito ad un enorme sviluppo di conoscenze nel campo della genomica. Il riconoscimento e l'analisi di sequenze nucleotidiche di DNA (acido desossiribonucleico) e le informazioni ad esse correlate, hanno trovato applicazioni in moltissimi settori, dalla ricerca in campo biologico, all'ambito clinico, diagnostico, farmaceutico, agroalimentare e anche medico-legale. L'analisi del DNA può essere vista come un insieme di fasi procedurali che ha inizio con la preparazione e l'estrazione del DNA dal campione, seguita poi dalla sua quantificazione, amplificazione e sequenziamento. Durante ognuna di queste fasi possono insorgere problemi, ma la fase di estrazione è nota per avere un grande effetto sulla correttezza del risultato dall'analisi. Questa fase infatti ha lo scopo di liberare il DNA contenuto nel nucleo di ogni cellula, e di purificarlo dalle proteine che lo rendono impuro e possono interferire con le successive analisi. L'importanza di avere un campione di alta qualità di DNA purificato non può quindi essere sottovalutata. L'estrazione del DNA viene effettuata nei laboratori biologici utilizzando tecniche manuali che richiedono l'utilizzo di provette, grandi quantità di reagenti e centrifughe da laboratorio. A causa dell'ingombro della strumentazione e alla necessità di personale qualificato, il processo di estrazione degli acidi nucleici rimane confinato all'interno di un laboratorio biologico. Data la crescente richiesta di strumenti per l'analisi del DNA di tipo point-of-care, anche le tecniche di estrazione degli acidi nucleici dovranno andare nella stessa direzione. L'idea del point-of-care è quella di utilizzare strumenti automatici, compatti, accurati e a costi accessibili che possano essere utilizzati anche da personale non specializzato. Una forte spinta verso la riduzione delle dimensioni di questi sistemi è stata fornita dallo sviluppo della tecnologia MEMS (Micro electro-mechanical Systems). Un dispositivo MEMS rappresenta un sistema altamente miniaturizzato che integra dispositivi di natura elettronica, elettrica e meccanica sullo stesso substrato di silicio. Tutti i componenti di un dispositivo MEMS, anche quelle non strettamente elettroniche, vengono realizzate utilizzando i processi standard per la produzione di circuiti integrati. L'unione di questa tecnologia con il recentissimo campo della microfluidica, che si occupa della manipolazione e del trasporto di piccolissime quantità di liquidi, ha portato alla nascita di nuovi dispositivi denominati Lab-On-Chip (LOC). Questi dispositivi integrano molteplici funzioni, analoghe a quelle svolte in laboratorio, su di un chip di dimensioni comprese tra il millimetro ed il centimetro quadrato. Nei Lab-On-Chip, a causa della grande superficie in rapporto al volume, effetti di superficie quali l'elettrostaticità e la bagnabilità dominano sugli effetti di volume come inerzia o massa termica. Rispetto ai sistemi di analisi biochimiche convenzionali, i Lab-On-Chip offrono innumerevoli vantaggi come la portabilità, la riduzione del volume dei reagenti, l'automazione, la produzione in massa, diminuzione dei tempi di analisi, l'alto rendimento e il basso consumo di energia. L'integrazione dell'intero processo di estrazione di acidi nucleici su un dispositivo microfluidico permetterebbe di automatizzare l'intero processo, di ridurre il consumo di reagenti e di evitare l'utilizzo di strumentazioni di laboratorio ingombranti. Mentre una grande attenzione è stata posta nello sviluppo di nuove tecnologie di analisi genomica su Lab-On-Chip, lo sviluppo di sistemi automatizzati per l'estrazione di acidi nucleici basati sulla stessa tecnologia è stato limitato. Queste limitazioni si ripercuotono anche sulla portabilità dei sistemi di amplificazione degli acidi nucleici basati su Lab-On-Chip, i quali richiedo in ingresso un campione di DNA già purificato. L'obiettivo di questo lavoro di tesi è la progettazione e lo sviluppo di un sistema compatto per l'estrazione di materiale genomico realizzato su Lab-On-Chip, che integri al suo interno tutti i componenti chimici ed elettronici necessari al processo di estrazione. Il DNA estratto con il sistema sviluppato potrà essere utilizzato da sistemi per analisi genomiche di tipo point-of-care. La relazione del lavoro di tesi è articolata in 6 capitoli. Il primo capitolo, offre una panoramica generale sulla struttura degli acidi nucleici e sulle tecniche utilizzate nei laboratori di biologia, per estrarre gli acidi nucleici. Il secondo capitolo, offre una panoramica sulla microfluidica, analizzando il comportamento dei fluidi quando vengono manipolati in canali di centinaia di micrometri. Verranno anche illustrati i componenti chiave che costituiscono un sistema microfluidico. Il terzo capitolo, offre una dettagliata descrizione di tutti i componenti del sistema realizzato per l'estrazione degli acidi nucleici. Per i componenti elettronici verranno illustrati i circuiti di condizionamento mentre per i componenti meccani verranno illustrate le caratteristiche e l'interfacciamento dei circuiti elettronici che ne permettono il controllo. Attraverso l'uso di diagrammi a blocchi si evidenzieranno le connessioni tra i singoli componenti e la scheda di controllo del sistema. In questo capitolo viene anche illustrato l'algoritmo utilizzato per calibrare un sensore ottico che permette di valutare lo stato di riempimento del circuito fluidico del sistema. Verrà anche illustrato l'algoritmo che gestisce la temporizzazione del braccio magnetico che permette l'agitazione delle microbiglie magnetiche. Infine verrà descritta la soluzione adottata per rilevare la posizione del motore. Il quarto capitolo racchiude tutti gli algoritmi e le soluzioni tecniche adottate per controllare in modo efficiente la micropompa piezoelettrica. Verrà spiegato il procedimento per ottenere un'onda quadra ad alta tensione partendo dai 12 Volt con cui il sistema viene alimentato. Si spiegherà nel dettaglio il funzionamento del controllore PID e di come siano stati calcolati i coefficienti del polinomio che permette all'algoritmo PID di stimare la tensione che alimenta la micropompa. Infine verranno illustrate le soluzioni tecniche adottate per poter generare differenti segnali di alimentazione della micropompa. Il quinto capitolo descrive i risultati raggiunti da ogni componente del sistema progettato. Verrà illustrato l'andamento della tensione di alimentazione della micropompa al variare del valore dei coefficienti del controllore PID. Si esporranno i risultati emersi dalla caratterizzazione fluidica e sonora della micropompa utilizzando diversi segnali di alimentazione. Verrà illustrato il modello tridimensionale del prototipo del sistema realizzato ed in conclusione si commenteranno i risultati della validazione dello strumento attraverso l'uso di tecniche di amplificazione. Il sesto capitolo illustra i risultati ottenuto dal sistema sviluppato in questo lavoro di tesi e propone alcuni miglioramenti futuri da apportare al sistema realizzato.