Optical projection tomography : advanced image analysis and contrast methods for developmental biology

During the last decades, biological research has shown a great interest for the study of complex organisms and small animal organs in their entirety, by imaging their complete structure in 3D. Small animal models and embryos, typically studied in cancer research and developmental biology, fall in the so called mesoscopic scale (0.5-1.5 mm). As a result, imaging techniques able to visualize them in 3D within minutes are highly desirable. Optical Projection Tomography (OPT) has been recently devised in order to perform tomographic visualization, i.e. three dimensional imaging, of mesoscopic samples. OPT is the optical analog of Computed Tomography, a medical technique which uses x-rays to reconstruct the 3D density distribution of tissues in the patient body. In OPT, instead, the sample is back-illuminated with visible light. The specimen is then rotated in order to capture on a camera several projections at different angular positions. Finally, mathematical reconstruction algorithms are applied to the set of projections, in order to obtain the virtual volume of the sample. However, attenuation and scattering properties of biological tissues limit the penetration depth of visible light, thus restricting applications of OPT to embryos and semi-transparent samples up to the millimeter scale. As a consequence, the use of chemical clearings is required to study bigger samples, preventing in-vivo experiments. The present thesis is a report on the research activity performed at the Department of Physics, Politecnico di Milano, for extending OPT applications to in vivo mesoscopic organisms and for investigating new contrast mechanisms able to yield quantitative physiological information. As a result, new technical solutions for OPT and innovative image processing algorithms have been devised and implemented. The following OPT-based techniques have been mainly developed, though not exclusively, for a specific model organism, the zebrafish (Danio rerio), which has been chosen for its fundamental role in today developmental biology and cancer research. After a general introduction on OPT and tomographic reconstruction methods, presented in Chapter 1, the thesis addresses the effects of photon scattering in OPT measurements. This problem is particularly significant when it is necessary to image large samples, like adult zebrafish. Indeed, scattering drastically reduces OPT contrast and resolution, preventing in vivo and time lapse measurements. To counteract this problem, we developed and tested a particular version of OPT, called Time-Gated OPT (TGOPT), which is described in Chapter 2. It uses second harmonic generation for selecting a limited temporal portion of a femtosecond light pulse that has passed through the diffusive sample. TGOPT is able to discriminate those photons that fall inside a 100 fs temporal window, allowing the detection of quasi-ballistic photons. Consequently, it rejects multiply scattered photons, which are responsible for blurring and resolution reduction in the acquired image. The results obtained with TGOPT applied to adult zebrafish are shown. We were able to visualize morphological details of the nervous and skeletal systems with a spatial resolution as small as 50 microns. Chapter 3 describes an innovative contrast mechanism for imaging the vascular network of zebrafish larvae in vivo. Indeed, tomographic reconstructions of the zebrafish cardiovascular system during embryo development is of paramount importance for the understanding of angiogenesis and vessel growth, which play a role also in pathological conditions like cancer. We named this technique Flow-OPT, since the contrast is given by the endogenous motion of blood cells inside vessels, without the use of fluorescent beads or staining. As a result, Flow-OPT opens the way to time lapse measurements on the same specimen and it gives the chance to follow angiogenesis in vivo. With an appropriate image analysis algorithm, it is possible to extract the position of moving blood cells in the acquired images, while rejecting all other still structures. As a result, it is possible to obtain a vascular contrast image which shows only the vessels. Then, the vascular network can be reconstructed in 3D by repeating the previously described procedure at different angular positions of the sample and by applying OPT reconstruction algorithms. Finally, Chapter 4 describes correlative image analysis methods that can be applied to OPT and other microscopy techniques for extracting quantitative information on the flow of particles. The first part of the Chapter is dedicated to a specific particle image velocimetry algorithm, based on spatio-temporal correlation of pixel intensity. It has been developed in order to quantify blood cell velocity inside vessels. It is useful to combine Flow-OPT reconstructions with quantitative information. The velocity vectors, obtained on 2D images, are then converted in the actual 3D velocity vector field with a custom algorithm implemented in Matlab (MathWorks). This procedure is called optical vector field tomography. The results obtained on zebrafish at different development stages are presented as well. The second part of Chapter 4, instead, reports the development of a correlative image analysis method for selective plane illumination microscopy (SPIM), which is another tomographic microscopy technique. This work has been carried out at the German Cancer Research Center, in Heidelberg, during about six months. In particular, a fluorescence correlation spectroscopy algorithm has been implemented in order to detect diffusion and direct flow of proteins inside human cancer cells. In the future, all these techniques and image analysis algorithms will be further improved to decrease the measurement time, while increasing signal-to-noise ratio. This would be helpful for in vivo applications and to follow zebrafish development from embryo to adult stage.

Recentemente, la ricerca biologica ha mostrato grande interesse per lo studio di organismi complessi tramite la visualizzazione tridimensionale della struttura completa dei loro tessuti e organi interni. Le dimensioni dei modelli animali e degli embrioni, studiati tipicamente nella ricerca sul cancro e nella biologia dello sviluppo, cadono solitamente nella cosiddetta scala mesoscopica (0.5-1.5 mm). Di conseguenza, risulterebbe molto utile poter applicare tecniche di microscopia 3D capaci di visualizzare questi campioni in pochi minuti. La tecnica di Tomografia a Proiezioni Ottiche (OPT) è stata da poco sviluppata proprio per soddisfare queste esigenze. L'OPT è l'analogo ottico della Tomografia Computerizzata, che è una tecnica medica basata sull'uso di raggi x per ricostruire la distribuzione di densità dei tessuti presenti nel corpo del paziente. Nell'OPT, invece, il campione è retroilluminato con luce visibile. Durante la misura, l'organismo viene ruotato e si acquisiscono su una telecamera un gran numero di immagini proiettive, ciascuna ad una diversa posizione angolare. Infine, algoritmi matematici di ricostruzione vengono poi applicati per ottenere un volume virtuale del campione. Tuttavia, le proprietà di assorbimento e diffusione della luce possedute dai tessuti biologici limitano la penetrazione della luce visibile. Ciò restringe il campo di applicazione dell'OPT a embrioni e campioni semitrasparenti con dimensioni millimetriche. Di conseguenza, è necessario ricorrere a tecniche di sbiancamento chimico dei tessuti per poter studiare campioni più grossi, impedendo la realizzazione di esperimenti in-vivo. Questa tesi è un resoconto dell'attività di ricerca svolta presso il Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano, atta ad estendere le applicazioni dell'OPT a organismi mesoscopici in-vivo e ad esplorare nuovi metodi di contrasto capaci di fornire informazioni quantitative sui campioni. In particolare, sono state concepite e realizzate nuove soluzioni tecniche e sono stati sviluppati algoritmi di analisi di immagine innovativi. Queste metodologie sono state sviluppate principalmente, ma non esclusivamente, per il modello animale zebrafish (Danio rerio), che è stato scelto per il suo ruolo fondamentale nella biologia dello sviluppo e la ricerca sul cancro. Dopo un'introduzione generale sull'OPT e sui metodi di ricostruzione tomografica, presentata nel Capitolo 1, la tesi si occupa di descrivere gli effetti della diffusione dei fotoni nei tessuti sulle misure. Questo problema è particolarmente evidente quando è necessario visualizzare campioni di grandi dimensioni, come zebrafish adulti. Infatti, la diffusione riduce drasticamente la risoluzione e il contrasto dell'OPT, impedendo misure in-vivo e prolungate nel tempo. Per contrastare questo problema, si è sviluppata e caratterizzata una specifica versione di OPT, chiamata Time-Gated OPT (TGOPT), la quale è descritta nel Capitolo 2. Essa sfrutta la generazione di seconda armonica per selezionare una porzione limitata di un impulso a femtosecondi che ha attraversato il campione diffondente. TGOPT è in grado di discriminare quei fotoni che cadono all'interno di una finestra di 100 fs, permettendo il rivelamento dei fotoni balistici. Di conseguenza, rimuove dalle immagini gli effetti di sfuocamento causati da quei fotoni particolarmente soggetti alla diffusione. In questo modo è possibile aumentare sia il contrasto che la risoluzione delle ricostruzioni 3D. Vengono mostrati anche i risultati ottenuti con TGOPT per la visualizzazione di uno zebrafish adulto. In particolare, è possibile evidenziare dettagli anatomici dei sistemi nervoso e scheletrico con una risoluzione spaziale di circa 50 micron. Nel Capitolo 3 viene descritto un metodo di contrasto innovativo per visualizzare la struttura vascolare in-vivo di zebrafish alla stadio larvale. La ricostruzione tomografica del sistema cardiocircolatorio è di vitale importanza per la comprensione dell'angiogenesi e della crescita dei vasi sanguigni, le quali hanno un ruolo rilevante anche in condizioni patologiche come il cancro. Questa tecnica viene chiamata Flow-OPT, dal momento che il contrasto è dato dal movimento endogeno delle cellule sanguigne, senza la necessità di dover usare particelle fluorescenti o coloranti. Di conseguenza, Flow-OPT apre la strada a misure ripetute nel tempo sullo stesso campione e permette di seguire l'angiogenesi in-vivo. Con un apposito algoritmo di analisi, si estraggono dalle immagini le posizioni delle cellule sanguigne in movimento, mentre si eliminano tutte le altre strutture immobili. In questo modo si ottengono mappe di contrasto vascolare che mostrano solo la posizione dei vasi. Ripetendo la procedura per molte posizioni angolari del campione, è possibile ricostruire in 3D l'intera struttura vascolare con gli algoritmi tomografici. Infine, il Capitolo 4 descrive metodi di analisi di immagine basati sulla correlazione, i quali possono essere applicati all'OPT e ad altre tecniche di microscopia per estrarre informazioni quantitative sul flusso di particelle. La prima parte del capitolo è dedicata ad un algoritmo di velocimetria di particelle, basato sulla correlazione spazio-temporale dell'intensità misurata dai pixel della telecamera. Il suo scopo è quello di quantificare la velocità delle cellule sanguigne nei vasi. E' utile per combinare le ricostruzioni di Flow-OPT con informazioni quantitative. I vettori di velocità, ottenuti in 2D, sono convertiti nel campo vettoriale 3D con un algoritmo appositamente scritto in Matlab (MathWorks). Questa procedura è chiamata tomografia ottica del campo vettoriale. Infine, vengono presentati i risultati ottenuti su zebrafish a diversi stadi dello sviluppo. La seconda parte del Capitolo 4, invece, descrive lo sviluppo di un metodo correlativo per l'nalisi d'immagine da applicare alla microscopia ad illuminazione selettiva di piano (SPIM), che è un'altra tecnica tomografica. Questo lavoro, della durata di circa sei mesi, è stato effettuato nel centro tedesco di ricerca sul cancro (DKFZ), in Heidelberg. Nello specifico, si è definito un algoritmo di spettroscopia a correlazione di fluorescenza per misurare la diffusione e il flusso direzionale di proteine all'interno di cellule cancerogene umane. In futuro, tutte queste tecniche e algoritmi verranno ulteriormente sviluppati per diminuire il tempo di misura, aumentando al contempo il rapporto segnale-rumore. Questo sarà utile per applicazioni in-vivo e per studiare in modo completo lo sviluppo dello zebrafish, dall'embrione allo stadio adulto.