Synthesis of new lead compounds with fungicidal activity

The aim of lead generation both in agrochemical and in pharmaceutical research is the discovery of molecules which cause a specific biological effect. In the case of agrochemicals, this means control of weeds (herbicides), fungi (fungicides) or insects (insecticides). Lead generation is the earliest stage in the discovery process of agrochemicals. The emphasis on in vivo activity studies reflects the fact that agrochemicals can be screened directly against the target organism. Early in vivo activity studies of agrochemical leads are done under glasshouse conditions. The transition to field tests represents a significant hurdle which a large proportion of leads fail, even after optimization work. Aim of this project is to find a new broad spectrum fungicide mainly active on the diseases of cereals, being inspired by chemical structures found in nature. As a result of constant monitoring of the scientific literature on this topic, we first identified new lead compounds from natural sources, with hints of antifungal activity. On this basis we hypothesized new classes of molecules, patentable and endowed with biological activity for use in the agronomic field. Convenient method of synthesis for a number of molecules belonging to each class were selected and applied in our research group laboratories. The products thus obtained and characterized were sent to biological evaluations, including both in vitro and in vivo studies. Data from in vitro activity carried out on a variety of fungi highlight the intrinsic activity of the molecules, and allow assessing the sensitivity of a certain strain towards the compounds under exam. In order to assess the spectrum of activity of our molecules, they were tested in vivo in greenhouse on the main diseases in preventive and curative tests. The first section of our research work was carried out starting from natural products, focusing on simplification of their chemical structures. Our research activity took the structure of tautomycetin, a natural molecule, as its initial model. Tautomycetin is a highly potent and specific protein phosphatase inhibitor isolated from Streptomyces griseochromogenes. Inspired by unusual dialkylmaleic anhydride moiety shared by tautomycetin and tautomycin, we expanded our search for a simplified structure, found in chaetomellic acid A. This class of alkyl dicarboxylic acids that were isolated from Chaetomella acutiseta, are potent and highly specific farnesyl-pyrophosphate (FPP) mimic inhibitors of Ras farnesyl-protein transferase. Himanimides, other natural molecules, were isolated from basidomycete culture as new maleimide derivatives which inhibit the growth of bacteria and fungi. In particular, the structure of himanimide C, possessing the N-hydroxylated maleimide moiety, was investigated by us as a lead compound. Ultimately the use of 3,4-disubstituted maleimide derivatives was patented as plant growth regulators, characterized by low rates of application. According to previous results, we decided to address our project to the discovery of fungicide molecules preserving the structure of maleic anhydride and imide and to introduce two different substituents in the 3,4 sites of the anhydride/imide ring. We selected a general synthesis path to diphenylmaleic anhydrides as a Perkin condensation of α-ketoacid potassium salt with phenylacetic acid by acetic anhydride. The synthesis of the maleimides was performed by treatment of anhydrides with urea. Similarly, the treatment of the anhydrides with N-hydroxylamine hydrochloride gave the N-hydroxylated products. Greenhouse data evidenced that our compounds had promising activity but showed drop in persistence, i.e. reduced activity over time, probably due to chemical degradation. In order to obtain more stable chemical structures and consequently improved persistence, we undertook the synthesis of compound belonging to the class of natural fimbrolide analogues, and their screening for biological activity. Fimbrolides, which have been isolated from red marine algae Delisea fimbriata, are bromobutenolides with interesting antifungal and antimicrobial properties. In the second section our studies continued on the synthesis of structurally natural products using cyclic anhydrides as precursors. We concluded that diphenylmaleic anhydride structures, together with the fimbrolide analogues, can be used as potential precursors for the synthesis of several bioactive compounds. The main drawback was represented by the stability of the molecules and the activity persistence. The preparation of additional compounds belonging to this class is currently under evaluation and the project will be continued in our chemistry department. We then continued our exploration on a parallel branch, in an effort to further increase the activity, and to obtain at least one active product to be applied in field trials. The third and final part was dedicated to a molecule proposed for development, its chemical synthesis and scale-up study and its application on pilot plant. We pursued the synthesis of a series of analogues starting from the andrimide structure. Andrimid is a pseudopeptide antibiotic, first discovered from the culture broth of an intracellular symbiont of Nilaparvata lugens. Its chemical structure includes β-phenyl-alanine and L-valine groups. Dipeptide compounds are known, having high antifungal activity, consisting of the L-valine conjugated through its carboxylic group with a -aromatic amino acid. We produced a single general structure formula where free carboxy and amino functions may be suitably derivatized, yet maintaining the L-valine fragment. Such aminoacid is common in nature and available as a chemical building block. The synthesis of several analogues and their biological evaluation led us to extract a synthetic study of a best candidate molecule and its final application on pilot plant intended to produce about 120 Kg of product per batch. The optimization carried out so far has had as its main effect in the preparation of a macro sample with satisfactory reduction of the costs and number of steps.

Lead generation nel campo agrochimico è la prima fase di un lungo processo di studio che porterà ad un nuovo prodotto, un lead è un composto chimico con una ben definita attività biologica nei confronti di un importante specie bersaglio, questo significa controllo delle erbe infestanti (diserbanti) , funghi (fungicidi) o insetti ( insetticidi). Ispirandosi a strutture chimiche già presenti in natura come lead di partenza, scopo di questo progetto è stato quello di ottenere un nuovo fungicida ad ampio spettro attivo soprattutto sulle malattie dei cereali. Come risultato del costante monitoraggio della letteratura scientifica e brevettuale, abbiamo identificato nuovi composti lead da fonti naturali con attività antifungina . Su questa base abbiamo ipotizzato nuove classi di molecole brevettabili e dotate di attività biologica per l'utilizzo in campo agronomico. Per sintetizzare un cospicuo numero di molecole appartenenti a ciascuna classe esaminata durante la tesi, sono stati selezionati e applicati nei nostri laboratori i metodi di sintesi più congeniali. Le molecole così ottenute sono state caratterizzate e inviate alle valutazioni biologiche, comprendenti i test sia in in vitro che in vivo. I dati provenienti dalle attività in vitro sono stati condotti su una varietà di funghi che ci hanno permesso di evidenziare sia l'attività intrinseca delle molecole sia di valutare la sensibilità di un certo ceppo verso i composti in esame. Le nostre molecole sono state inoltre testate in vivo (prove in serra) sulle principali malattie per valutare lo spettro di attività preventiva e curativa. La prima parte del nostro lavoro è stata realizzata partendo da prodotti di origine naturale concentrandoci soprattutto sulla semplificazione delle strutture chimiche. L’attività di ricerca ha preso come modello iniziale la struttura della tautomicetina. Ispirati dall’insolita struttura dell’anidride dialchil maleica, condivisa sia da tautomicetina che tautomicina, abbiamo ampliato la nostra ricerca puntando ad una struttura semplificata che si può riscontrare nell’acido chaetomellico A, seguita dalla struttura del himanimide C che possiede la porzione maleimmidica N-idrossilata. In seguito si è preso spunto dalla struttura di derivati maleimidici 3,4-disostituiti, brevettati come regolatori di crescita delle piante, caratterizzati da basse dosi di applicazione. Prima parte di questo progetto si è quindi concentrata sullo studio di molecole fungicide che mantenessero la struttura dell’anidride maleica e immidica e di introdurre due sostituenti in posizione 3,4 sull'anello dell’anidride e immide. Il percorso di sintesi generale da noi selezionato per l’anidride difenilmaleica è stata una reazione di condensazione di Perkin di sali di α-chetoacidi con acido fenilacetico mediante anidride acetica. La sintesi della maleimmide è stata ottenuta per trattamento con urea della corrispondente anidride. Allo stesso modo, il trattamento dell'anidride con cloridrato di N-idrossilammina ha dato il prodotto N-idrossilato. I dati di serra hanno evidenziato che i nostri composti avevano una buona attività di partenza seguita però da un calo di persistenza, cioè l'attività ridotta nel corso del tempo, probabilmente a causa della degradazione chimica delle strutture. Al fine di ottenere strutture chimiche più stabili e quindi elevata persistenza, abbiamo intrapreso la sintesi di composti appartenenti alla classe degli analoghi di fimbrolidi naturali e relativa programmazione per l'attività biologica. I fimbrolidi, anch’essi composti di origine naturale, sono bromobutenolidi con interessanti proprietà antifungine ed antimicrobiche. Nella seconda parte della tesi abbiamo proseguito i nostri studi sulla sintesi di prodotti strutturalmente naturali utilizzando anidridi cicliche come precursori. Abbiamo concluso che le strutture dell’anidride difenilmaleica, insieme agli analoghi dei fimbrolidi, possono essere utilizzati come potenziali precursori per la sintesi di diversi composti con una buona attività biologica, pur evidenziando il principale svantaggio legato alla stabilità delle molecole e la persistenza di attività. La preparazione di ulteriori composti appartenenti a questa classe è attualmente in fase di valutazione e il progetto proseguirà nel nostro dipartimento di chimica. Abbiamo poi continuato la nostra esplorazione su un ramo parallelo, con l’obiettivo di migliorare l'attività per poter sperimentare almeno un prodotto in prove di campo. La terza e ultima parte della tesi è stata quindi dedicata ad una molecola proposta per lo sviluppo, lo studio della sua sintesi chimica in più larga scala, e la sua applicazione su impianto pilota. Abbiamo perseguito la sintesi di una serie di analoghi ispirandoci alla struttura chimica dell’andrimide, che comprende i gruppi β-fenilalanina e L-valina. Composti a struttura dipeptidica, costituiti dalla L-valina coniugata attraverso il suo gruppo carbossilico con un amminoacido -aromatico, sono noti e presentano elevata attività antifungina. I frammenti carbossi e ammino possono essere opportunamente derivatizzati dando una singola formula generale, che mantiene la porzione dell’L-valina, amminoacido che è comune in natura e facilmente reperibile come intermedio chimico. La sintesi di vari analoghi e loro valutazione biologica ci ha portato a estrarre un'unica molecola candidata e la sua applicazione finale su impianto pilota destinato a produrre circa 120 Kg di prodotto per ogni batch. L'ottimizzazione condotta finora nella preparazione di questo macrocampione ha avuto come effetto principale una soddisfacente riduzione dei costi e numero di passaggi.