Sviluppo e validazione biologica di sistemi sperimentali per l'ingegneria del tessuto renale

Chronic kidney disease is a pathological condition marked by a progressive loss of renal function. Hemodialysis and organ transplantation are the only clinically available treatment. However, most of the world population has limited or no access to these therapies. Complications related to dialysis and the limited availability of organs for transplantation remain unsolved issues. Over the past five years, tissue engineering has focused on the purpose of regenerating functional whole-kidney by seeding extracellular matrix scaffold with pluripotent stem cells. In the majority of the studies on kidney regeneration, cells are seeded into the scaffold by renal artery anterograde perfusion. However, this method effectively repopulate only the vascular compartment of the organ. The present work, carried out at the Mario Negri Institute in Bergamo, focused first on the development of a perfusion chamber for the decellularization and subsequent recellularization of rat kidney (Fig. 1, left). To reach the tubular segment, in this work we perfused murine embryonic stem cells (mES) from ureter maintaining a negative pressure to the perfusion chamber during cell seeding. On the basis of the rat kidney perfusion system, we designed and developed a similar device to perfuse pig kidney, in order to allow the scale-up of the experimental protocols to the porcine organ (Fig. 2, left). Finally, we developed and constructed a device to measure dissolved oxygen concentra-tion in culture medium in order to monitor oxygen delivery to the recellularized organ (Fig. 3, right). Results obtained during rat kidney perfusion allow to define a new experimental proto-col with a better seeding efficiency compared to previous techniques based on renal artery perfusion.The scale-up of this new protocol to decellularize pig kidney allowed to obtain intact a-cellular matrices with perfectly preserved structures. Moreover, subsequent seeding of murine embryonic stem cells within these scaffolds allowed to reach satisfactory results, with a good recellularization of both vascular and tubular compartments. Finally, experimental measurements of dissolved oxygen concentration (Fig. 3, right) of culture medium highlighted the need of greater oxygen delivery to the cells within the organ during perfusion, especially for future long-term experiments. Although the improvements achieved with the new devices developed during this year, some major issues still remain to be addressed in order to obtain more suitable systems for the future development of the experimental activity.

L’insufficienza renale cronica è una condizione patologica caratterizzata da una perdita progressiva della funzionalità renale. A livello clinico, le uniche opzioni di cura attualmente disponibili sono l’emodialisi e il trapianto d’organo. Tuttavia, le complicanze legate al trattamento emodialitico, così come la scarsa disponibilità di organi per il trapianto, rimangono problemi irrisolti. Negli ultimi cinque anni, l’ingegneria dei tessuti si è focalizzata sulla rigenerazione dell’intero organo renale attraverso l’uso di uno scaffold in matrice extracellulare seminato con cellule pluripotenti. La maggior parte dei lavori disponibili in letteratura sul tema della rigenerazione del rene è basata su tecniche di semina con infusione anterograda dall’arteria renale. Tuttavia, queste procedure risultano efficaci solo per ripopolare il comparto vascolare dell’organo. Il presente lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri di Bergamo, ha avuto come primo obiettivo lo sviluppo di un sistema di perfusione (Fig. 1, a sinistra) per gli esperimenti di decellularizzazione e successiva ricellularizzazione del rene di ratto attraverso la semina di cellule embrionali murine (mES). Per raggiungere anche il comparto tubulare, in questo lavoro si è proceduto alla semina delle cellule dall’uretere imponendo una pressione negativa alla camera di perfusione. In secondo luogo, sulla base del sistema di perfusione del rene di ratto, è stato quindi progettato e sviluppato un analogo dispositivo per la perfusione del rene di maiale, al fine di permettere lo scale-up dei protocolli sperimentali all’organo porcino (Fig. 2, a sinistra). In ultimo, si è proceduto alla realizzazione di un dispositivo di misurazione della concentrazione di ossigeno nel terreno di coltura al fine di ottenere un primo monitoraggio delle condizioni di ossigenazione dell’organo ricellularizzato (Fig. 3, a sinistra). I risultati ottenuti negli esperimenti con il dispositivo di perfusione del rene di ratto hanno permesso la definizione di un nuovo protocollo sperimentale che ha dimostrato una maggior efficienza di ripopolamento rispetto alla precedente tecnica basata sulla sola semina da arteria (Fig. 1, a destra). Il trasferimento di queste procedure negli esperimenti preliminari nel rene di maiale ha inoltre permesso di ottenere matrici decellularizzate integre e con una struttura perfettamente conservata. La successiva semina di cellule embrionali murine all’interno di questi scaffold ha consentito di raggiungere dei risultati preliminari soddisfacenti, con una buona ricellularizzazione sia del comparto vascolare che di quello tubulare come mostra-to in Fig. 2 (a destra). Infine, i risultati delle prove sperimentali (Fig. 3, a destra) condotte con il sistema di misurazione dell’ossigeno hanno evidenziato la necessità di provvedere a una maggiore ossigenazione delle cellule seminate, soprattutto nell’ottica di un futuro prolungamento dei tempi di coltura. Questi risultati hanno dimostrato da una parte la funzionalità e la conformità dei tre sistemi realizzati rispetto alle specifiche individuate in fase di progetto , ma hanno anche evidenziato alcune problematiche che dovranno essere affrontate al fine di ottenere un sistema più adatto al futuro sviluppo dell’attività sperimentale.