Synthesis and characterization of RGD functionalized hydrogels for cell adhesion

La lesione del midollo spinale (LMS) rappresenta uno dei traumi più critici in grado di provocare una significativa disabilità. Ad oggi, circa 330.000 cittadini europei risultano essere colpiti da un evento incidentale di questo tipo (http://www.eurostemcell.org), che in genere è conseguenza di un incidente (ad esempio, un incidente automobilistico o sportivo), o di un atto di violenza come una ferita d’arma da fuoco, o causato da complicanze chirurgiche o da patologie come poliomielite e spina bifida. Le conseguenze posso essere classificate in due categorie: quelle “primarie” o immediate che conducono all’interruzione delle vie nervose ascendenti e discendenti lungo il midollo stesso a seguito della sua contusione, compressione o stiramento; quelle “secondarie”, invece, sono a carattere patologico e portano a gravi disabilità motorie e sensoriali, accompagnate anche da paralisi di arti superiori e/o inferiori. Attualmente non esistono trattamenti in grado di riparare completamente un midollo spinale lesionato: cure mediche immediate, come l’immobilizzazione e il rinforzo per stabilizzare la colonna vertebrale, possono al più aiutare a ridurre al minimo i danni alle cellule nervose. LMS è una situazione complessa che implica diversi tipi di danno a cellule differenti; l’ambiente del midollo spinale subisce cambiamenti rilevanti durante le prime settimane post-infortunio, in quanto cellule del sistema immunitario vengono richiamate nel sito di danno, vengono rilasciate sostanze tossiche e si forma una cicatrice che genera la discontinuità permanente nella trasmissione di informazioni nervose da e per il sistema nervoso centrale. In questo contesto, l’ingegneria tissutale tende ad essere largamente configurata come una tecnologia promettente per la medicina rigenerativa e la cura della salute. “L’ingegneria dei tessuti” fonda i suoi principi sullo studio e applicazione di una intelligente combinazione di cellule e materiali in grado di poter sostituire parti mancanti o riparare quelle danneggiate di tessuti viventi. In generale, si tratta di “costruire” una struttura biologicamente attiva e compatibile capace di trasportare farmaci e/o cellule appropriati che, ad esempio nel caso della lesione del midollo spinale, possano portare alla soppressione dell’infiammazione (prevenendo così la diffusione della lesione), alla protezione delle cellule nel sito di lesione da ulteriori danni attraverso il rilascio di sostanze protettive come fattori di crescita e alla sostituzione di cellule nervose morte con nuove capaci di stimolare la riconnessione tra le fibre nervose interrotte. La ricerca propone gli idrogeli come classe di efficienti veicoli di trasporto: strutture polimeriche tridimensionali dotate di elevata biocompatibilità e possibilità di rilascio controllato dei farmaci e delle cellule caricate. Sulla base di quanto detto, un’adeguata combinazione di idrogeli e cellule staminali potrebbe presentarsi come terapia promettente. Sfortunatamente i polimeri commerciali, pur essendo biocompatibili, non garantiscono un’elevata vitalità cellulare ed è per questo che vengono funzionalizzati usando strategie di click chemistry. In questo lavoro di tesi ci si è dedicati allo studio della funzionalizzazione di materiali polimerici, quali acido poliacrilico (PAA) e polietilen glicole (PEG), con un tripeptide (RGD) capace di migliorare l’adesione di cellule staminali al substrato polimerico dell’idrogelo. L’aspetto chimico preso in esame verte sulla determinazione di una metodologia in grado di far fronte all’obiettivo di attacco del tripeptide alla catena polimerica, sfruttandone i gruppi funzionali caratteristici. Entrambi i polimeri sono stati funzionalizzati attraverso l’inserimento di alchini nella loro struttura lineare. Per il PAA sono state indagate due procedure: la prima relativa alla reazione con propargilammina che ha portato alla formazione della corrispondente ammide, e la seconda riguardante l’esterificazione del polimero per reazione con propargiltosilato. Il PEG invece è stato trattato secondo altre due metodologie: in una prima prova con propargil bromuro e in una seconda procedura con CDI-alcol propargilico; entrambe con il fine di ottenere l’attacco del triplo legame sul gruppo funzionale terminale –OH. I risultati ottenuti in tali prove sono stati adeguatamente confrontati per valutarne vantaggi e svantaggi in termini di stabilità e reattività chimica del prodotto. Allo stesso modo, è stato sintetizzato un composto RGD-spacer-azide. I composti così formulati sono stati utilizzati nella reazione di CuAAC (Copper catalyzed Alkyne-Azide Cycloaddition) click, dove l’interazione alchino-azide, in presenza di catalizzatore, ha permesso, mediante la formazione di triazolo, l’aggancio del tripeptide alla catena polimerica. Infine, gli idrogeli sintetizzati sono stati caricati con cellule staminali mesenchimali e attraverso prove di carattere biologico, condotte all’Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, è stata valutata l’efficacia della funzionalizzazione. I risultati ottenuti, confrontati con la stessa formulazione senza RGD, hanno confermato la validità delle metodologie adottate registrando un incremento significativo nella sopravvivenza cellulare all’interno dei nostri idrogeli.