Relazione struttura-attività di complessi PEI/DNA per gene delivery : ruolo del protocollo di preparazione

Gene therapy is an experimental technique that exploits the exogenous genetic material insertion (gene delivery) inside a cell in order to modify, temporarily or permanently, its protein expression profile, to treat or prevent diseases. This is done to create a therapeutic effect, by fixing an anomaly or by giving to the cell a complete new function. The objective is to treat the causes rather than symptoms of diseases. The different categories of gene delivery systems can be mainly divided in viral methods and non viral methods. The efficiency of non viral gene delivery systems is inferior compared with the viral ones, but the better cost/efficiency ratio, the higher simplicity, the rapid preparation, and mostly the higher safety, make them a valid and often better alternative. Non viral chemical systems for gene delivery are molecules or macromolecules that are able to convey the genetic material inside the target cells. In this way the genetic material is protected from extracellular degradation and its entrance is facilitated: this process is known as transfection. One category of chemical vectors is represented by cationic polymers, which spontaneously form complexes with the genetic material (polyplexes) through electrostatic interaction between their positive and negative charges of the nucleic acids' phosphate groups. The polymeric systems are characterized by several properties (molecular weight, polydispersity, branching degree, etc), which may be finely selected and controlled, in order to obtain DNA complexes with specific chemical/physical characteristics. One of the most employed cationic polymer for gene delivery is Polyethyleneimine (PEI), that in this work is used in its linear (lPEI) and branched (bPEI) form as polymeric reagent for the polyplexes complexation. As the transfection process strongly depends on the interaction between the surrounding environment and the polymer-DNA complexes, a deep knowledge of their chemical/physical properties and a careful evaluation of their biological activity are necessary,in order to establish a correlation between the two aspects and to achieve a better optimization of the preparation and transfection protocols. Various studies were conducted on PEI, in order to evaluate its ability to form complexes with DNA and the transfection efficiency of the resulting polyplexes. Despite the amount of data and results obtained over the years, a complete chemical/physical and biological characterization of the polyplexes formed with this polymer was not achieved yet. This is due to the several factors involved both in the complexation process of the PEI/DNA complexes and in the transfection one, and, on the other side, to the lack of systematicity and clarity with which some studies were led. The aim of this work is to characterize PEI/DNA complexes, paying attention to the influence that the complexation protocol and then the transfection protocol may have on the chemical/physical properties of polyplexes and on their in vitro transfection efficiency. The chemical/physical characterization of the PEI/DNA complexes, prepared through different complexation protocols, is based on measurements of their dimensions and of their zeta potential. The instrument Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK), which exploits the DLS technique (Dynamic light Scattering) was used to perform these measurements. The biological characterization experiments were made, if not differently specified, on HeLa cells and using the pGL3 plasmid (a Luciferase reporter vector) for the complexes formation. This plasmid codifies for the Modified Firefly Luciferase, which catalyzes the oxidation of a specific substrate, the luciferine, with consequent light emission. Its intensity is proportional to the amount of synthetized protein. The intensity values (expressed in RLU, Relative Light Units) was standardized with respect to the total protein content, quantified through the BCA protein assay, and used as markers of PEI/pGL3 complexes in vitro transfection efficiency. In order to evaluate the polyplexes cytotoxicity, an assay with a metabolic cellular activity indicator (Alamar Blue) was employed. The ratio between the polymer positive charges and the phosphates negative charges (N/P ratio) used in complexes preparation was chosen through complexation experiments using SYBR Green and a fluorimetric analysis of complexes formed at different N/P ratios. It was also performed an in vitro transfection experiment in order to evaluate the influence of N/P ratio on the efficiency and citotoxicity of the complexes. From the obtained results, an N/P ratio of 30 was chosen and maintained constant for all the experiments. Polyplexes used in chemical/physical and biological characterization experiments were obtained with different preparation protocols, by varying the type of the chosen polymer (bPEI; lPEI), the complexation buffer (Hepes 10mM; NaCl 150mM), the addition order and the mixing modality of the reagents. The chemical/physical characterization of polyplexes diluted in buffer was made in terms of dimension and of superficial charge (zeta-potential). The results showed that polyplexes prepared by mixing the reagents have lower hydrodynamic diameter values (150-200 nm) than the ones prepared without mixing (240-350 nm). In case of complexes obtained with lPEI-NaCl, their polydispersity prevented to obtain reliable dimensional values. Concerning the zeta-potential, the values recorded are in a range between 24 and 31 mV, with the exception of the poliplexes lPEI-NaCl. In this case the values are lower (17-20 mV) and their variability between different measurements is bigger. A dimensional characterization was also conducted for polyplexes diluted in cellular culture medium (complete DMEM with 10% of fetal bovine serum FBS; Opti-MEM ; complete DMEM without FBS), reproducing the transfection experimental conditions. It has not been possible to evaluate the zeta-potential of polyplexes diluted in these media because of technical problems due to their protein content. Through 4 hours long measurement, time considered as sufficient for the completion of the in vitro internalization process, polyplexes dimension values in complete DMEM 10% FBS show a very limited growth in time, keeping the same differences between complexes made through different mixing methods. On the contrary, polyplexes in Opti-MEM and complete DMEM without FBS show a quick aggregation, reaching micrometric and comparable values of hydrodynamic diameter. Regarding to the biological characterization, the transfection experiments we- re conducted on HeLa cells in complete DMEM 10% FBS, Opti-MEM and complete DMEM without FBS. In complete DMEM 10% FBS, the polyplexes obtained without mixing the reagents showed a transfection efficiency significantly higher than the corresponding ones obtained by mixing. This happens in all the typologies of polyplexes, except for the ones made with lPEI and NaCl, that shown similar values instead. The transfection efficiencies of the polyplexes in the other two cellular culture medium are, instead, very similar and different from the one in complete DMEM 10% FBS. In both cases, there are not significant differences in transfection efficiencies obtained with different mixing methods. It appears that the preparation protocol affects both the chemical-physical properties and the in vitro transfection efficiencies, in relation also to the medium used in the experiment. In order to verify this hypothesis under different transfection conditions, changes on DNA doses and on medium volume per well were made, obtaining different concentration of polyplexes in the medium. The dependence of the transfection efficiencies on the preparation protocol is confirmed even with these variations. These changes led to much lower transfection efficiencies and much remarked differences between polyplexes obtained through different methods of mixing. In some transfection experiments in complete DMEM 10% FBS, a culture plate centrifuge was used immediately after having dosed the polyplexes to cells (1200G, 5 min). This has been done to facilitate the polyplexes sedimentation process and their contact with cells on the bottom of the well, in order to limit the behavioral differences between polyplexes in solution with different chemical-physical characteristics. The transfection efficiency values obtained are higher than for the other experiments and the differences between the two mixing methods are no longer significant, proving in this way the influence of chemical-physical properties on the in vitro transfectant ability. A single preliminary transfection experiment was conducted on COS-7 cells in medium complete DMEM 10% FBS, obtaining a transfection efficiencies pattern very similar to the one obtained with HeLa cells. The results presented in this work show how the chemical-physical properties of PEI/DNA complexes depend on the particular preparation protocol used: this is true for the preparation of both the polyplex solution (complexation protocol) and the transfection solution. It is explained how the mixing method used during the complexation affects the polyplexes properties (in particular their dimensions) and how this affects the final in vitro efficiencies. Moreover, factors such as the culture medium, the complexes concentration in solution, and even the gravity force applied to the culture wells, act to increase or lower differences in transfection efficiencies, due to the different chemical-physical properties of polyplexes. In conclusion, a deep analysis of the preparation protocol appears to be extremely important: this results to be an aspect that must be taken into account during the study of PEI/DNA complexes properties and a possible comparison with other polyplexes.

La terapia genica (gene therapy) e’ una tecnica sperimentale che sfrutta l’inserimento di materiale genetico esogeno (gene delivery) all’interno di una cellula al fine di alterarne transitoriamente o permanentemente il profilo di espressione proteica per il trattamento o la prevenzione di malattie. Cio` viene fatto per generare un effetto terapeutico correggendo una anomalia o fornendo alla cellula una nuova funzione, con l’obiettivo di debellare le malattie alla loro origine, mirando a sopprimerne le cause piuttosto che curarne i sintomi. In generale la suddivisione piu` utilizzata per identificare le diverse categorie di sistemi per gene delivery e’ quella che li distingue in metodi virali e metodi non virali. 
L’efficienza di trasfezione dei sistemi non virali e’ inferiore rispetto a quella dei sistemi virali, ma il migliore rapporto costo-efficacia, la maggiore semplicita` e rapidita` di preparazione e, soprattutto, la loro maggiore sicurezza, li rendono una valida e spesso migliore alternativa. Nel caso di sistemi non virali chimici, viene fatto uso di sostanze che veicolano il materiale genetico all’interno delle cellule bersaglio, proteggendolo dalla degradazione extracellulare e facilitandone l’ingresso, in un processo noto come trasfezione. Una categoria di vettori chimici e’ quella dei polimeri cationici, i quali formano spontaneamente complessi (poliplessi) con il materiale genetico attraverso interazione elettrostatica tra le loro cariche positive e le cariche negative dei gruppi fosfati degli acidi nucleici. I sistemi polimeri- ci sono caratterizzati da numerose propriet`a (peso molecolare, polidispersita’, grado di ramificazione, etc) che possono essere finemente selezionate e controllate, al fine di ottenere complessi con il DNA con specifiche caratteristiche chimico-fisiche. Uno dei polimeri cationici maggiormente usati come sistema per gene delivery e’ il PEI (Polietilenimmina), utilizzato nel presente studio nella sue forma lineare (lPEI) e ramificata (bPEI) come reagente polimerico per la formazione dei poliplessi. Dal momento che il processo di trasfezione e’ fortemente dipendente dall’interazione tra l’ambiente circostante e il complesso polimero-DNA, risulta necessaria una conoscenza approfondita delle caratteristiche chimico-fisiche iniziali di quest’ultimo e un’attenta valutazione della sua attivita` biologica, al fine di stabilire la correlazione tra questi due aspetti, in modo da permettere una migliore ottimizzazione del protocollo di preparazione e di trasfezione. Nel caso del PEI, numerosi studi sono stati condotti per valutare la sua abilita` di complessazione del DNA e la capacita` trasfettante dei poliplessi risultanti. Nonostante la mole di dati e risultati ottenuti negli anni, pero’, non e’ ancora stata sviluppata una completa caratterizzazione chimico-fisica e biologica dei poliplessi formati con tale polimero. Cio` e’ dovuto, da un lato, ai numerosi fattori implicati sia nel processo di formazione dei complessi PEI/DNA che in quello di trasfezione, e, dall’altro, alla mancanza di sistematicita’ e chiarezza nei modi in cui sono stati condotti alcuni studi. Il presente lavoro si e’ posto come obiettivo proprio quello di procedere nella caratterizzazione dei complessi PEI/DNA, con particolare attenzione all’influenza che il protocollo di complessazione e, in secondo luogo, il protocollo di preparazione delle soluzioni trasfettanti (transfection solution) possono avere sulle caratteristiche chimico-fisiche dei poliplessi ottenuti e sulla loro abilita` trasfettante in vitro finale. La caratterizzazione chimico-fisica dei complessi PEI/DNA, preparati tramite diversi protocolli di complessazione, si basa sulla misurazione delle loro dimensioni e del loro potenziale zeta. Per effettuare tali misurazioni si e’ utilizzato lo strumento Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) che sfrutta la tecnica DLS (Dynamic light Scattering). Gli esperimenti di caratterizzazione biologica sono stati effettuati, se non diversamente specificato, su cellule HeLa e utilizzando per la formazione dei complessi il plasmide pGL3, Luciferase reporter vector, che codifica per la Modified Firefly Luciferase. L’enzima codificato dal plasmide catalizza l’ossidazione di uno specifico substrato, la luciferina, con conseguente emissione di luce la cui intensita` e’ proporzionale alla quantita` di proteina sintetizzata. I valori di intensita’ (espressi in RLU, Relative Light Units) sono stati poi standardizzati rispetto al contenuto proteico totale, quantificato attraverso il BCA protein assayTM,e utilizzati come indicatori dell’efficienza di trasfezione dei complessi PEI/pGL3. Per valutare la citotossicita` dei poliplessi e’ stato effettuato il saggio con AlamarBlueT M , indicatore dell’attivita` metabolica delle cellule. Il rapporto tra le cariche positive del polimero e le cariche negative dei fosfati del DNA (N/P ratio) utilizzato per la formazione dei poliplessi e’ stato scelto attraverso esperimenti di complessazione tramite l’utilizzo di SYBR Green e analisi fluorimetrica di complessi formatisi a differenti N/P ratio, e attraverso esperimenti di trasfezione in vitro per valutarne le rispettive efficienze di trasfezione e citotossicita`. Dai risultati ottenuti e’ stato scelto un N/P ratio pari a 30, mantenuto costante per tutta la durata degli esperimenti. I poliplessi utilizzati per gli esperimenti di caratterizzazione chimico-fisica e biologica sono stati ottenuti attraverso differenti protocolli di preparazione, variando la tipologia del polimero scelto (bPEI; lPEI), il buffer di complessazione (Hepes 10mM; NaCl 150mM), l’ordine di aggiunta e la modalita` di miscelazione dei reagenti. La caratterizzazione chimico-fisica dei poliplessi dispersi nei due buffer mostra che per i poliplessi in cui l’aggiunta dei reagenti e’ avvenuta tramite mescolamento si rilevano valori di diametro idrodinamico (150-200 nm) inferiori a quelli dei poliplessi ottenuti tramite semplice gocciolamento dei reagenti (240-350 nm). Nel caso di complessi ottenuti con lPEI-NaCl, la polidispersita` di questi ultimi ha impedito l’ottenimento di valori dimensionali attendibili. Per quanto riguarda la carica superficiale, i valori di potenziale zeta misurati rientrano in un range di valori compreso tra 24-31 mV, ad eccezione dei poliplessi lPEI-NaCl, per i quali i valori risultano piu` bassi (17-20 mV) e la loro variabilita` tra diverse misurazioni maggiore. La stessa caratterizzazione chimico-fisica, ma in termini solamente dimensionali, e’ stata eseguita anche su poliplessi dispersi in terreno di coltura cellulare (DMEM completo con 10% di siero fetale bovino FBS, Opti-MEM e in DMEM completo senza FBS), riproducendo quindi le condizioni sperimentali di trasfezione. Non e’ stato, invece, possibile eseguire alcuna valutazione del potenziale zeta in questi terreni a causa delle problematiche tecniche riguardanti una sua misurazione affidabile in terreni con contenuto proteico. Attraverso misurazioni protratte per 4 ore, tempo considerato sufficiente per il completamento del processo di internalizzazione in vitro, si e’ visto come in DMEM completo 10% FBS le dimensioni dei poliplessi presentino una crescita molto limitata nel tempo, mantenendo le differenze tra complessi preparati con un diverso metodo di miscelazione. Al contrario, i poliplessi dispersi in Opti-MEM e DMEM senza FBS, mostrano una rapida aggregazione che porta a valori di diametro idrodinamico micrometrici e paragonabili tra loro. Per quanto riguarda la caratterizzazione biologica, gli esperimenti di trasfezione sono stati condotti su cellule HeLa in DMEM completo 10% FBS, Opti-MEM e DMEM completo NO FBS.
 Dagli esperimenti in DMEM completo 10% FBS, si e’ visto che i poliplessi ottenuti senza alcun mescolamento dei reagenti mostrano un’efficienza di trasfezione significativamente maggiore rispetto ai corrispettivi ottenuti con mescolamento. Cio` e’ visibile in tutte le tipologie di poliplessi, ad eccezione di quelli formati con lPEI e NaCl,i quali mostrano invece valori simili, come gia` riscontrato per i valori dimensionali. Le efficienze di trasfezione dei poliplessi negli altri due terreni di coltura sono, invece, molto simili tra loro e differenti da quelle in DMEM completo 10% FBS: in entrambi i casi, infatti, non si notano differenze significative nei valori di efficienza tra poliplessi ottenuti con differenti modalita’ di miscelazione. Da questi risultati appare quindi come il protocollo di preparazione influenzi, oltre che le caratteristiche chimico-fisiche dei complessi, anche la loro efficienza di trasfezione in vitro, e come cio’ sia dipendente anche dal particolare terreno di coltura utilizzato. Al fine di validare tale ipotesi anche in condizioni di trasfezione differenti, sono state apportate modifiche alle dosi di DNA e al volume di terreno per pozzetto utilizzati, modifiche, cio`e, alla concentrazione dei poliplessi in soluzione. La dipendenza dell’efficienza di trasfezione dal particolare protocollo di preparazione dei complessi viene confermata anche apportando tali variazioni al protocollo di trasfezione. Inoltre si nota che a una dose minore di DNA e a un aumento del terreno corrispondono efficienze di trasfezione molto inferiori e differenze molto piu` marcate tra poliplessi ottenuti tramite diverse modalita’ di miscelazione. Inoltre, in alcuni esperimenti di trasfezione in DMEM completo 10% FBS e’ stata utilizzata una centrifuga per piastre di coltura cellulare immediatamente dopo aver somministrato i poliplessi alle cellule (1200G, 5 minuti), al fine di facilitare la sedimentazione dei complessi e il loro contatto con le cellule sul fondo del pozzetto, limitando cos`ı le differenze di comportamento tra poliplessi in soluzione con diverse caratteristiche chimico-fisiche. I valori di efficienza di trasfezione ottenuti sono piu` elevati rispetto agli altri esperimenti e le differenze tra le due modalita` di miscelazione non piu` significative, dimostrando quindi l’influenza delle diverse propriet`a chimico-fisiche dei complessi sulla loro abilita` trasfettante in vitro. E’ stato inoltre svolto un singolo esperimento di trasfezione preliminare su cellule COS-7 in terreno DMEM completo 10% FBS, ottenendo un andamento delle efficienze di trasfezione molto simile a quello ottenuto con le cellule HeLa nello stesso terreno. I risultati ottenuti hanno permesso di identificare quindi una forte dipendenza delle caratteristiche chimico-fisiche dei complessi PEI/DNA dal particolare protocollo di preparazione utilizzato: questo e’ vero nel caso della preparazione sia delle polyplex solution (protocollo di complessazione), sia delle transfection solution (protocollo di trasfezione). Si e’ visto, quindi, come il metodo di miscelazione utilizzato in fase di complessazione influenzi le caratteristiche dei poliplessi (in particolare le dimensioni), e come cio’ si ripercuota sulla loro efficienza finale in vitro a seconda del particolare protocollo di trasfezione. Fattori come il terreno di coltura, la concentrazione di complessi in soluzione, e addirittura la forza gravitazionale applicata al pozzetto di coltura, risultano accentuare o limitare, infatti, le differenze osservate per le efficienze di trasfezione, le quali tendono ad essere presenti a causa delle differenze nelle caratteristiche chimico-fisiche dei poliplessi (quest’ultime dovute ai diversi protocolli di preparazione). In conclusione, un’analisi accurata del protocollo di preparazione appare di fondamentale importanza ed esso risulta essere un aspetto da tenere in seria considerazione nel momento in cui si procede nella valutazione delle proprieta` di complessi PEI/DNA o nel confronto tra diverse tipologie di poliplessi.