Impiego di un bioreattore ad alta pressione per lo studio di fattori di trascrizione implicati nella meccanotrasduzione di cellule cartilaginee

The present work aims to exploit and validate a bioreactor applying high pressure to the study of transcription factors involved in mechanotransduction in cartilage cells. The bioreactor used is a built in stainless steel AISI 316L. The bioreactor is capable of applying alternate regimes of high hydrostatic pressure and dynamic perfusion. After verifying the functionality of the system, we performed tests of biological validation of cell culture. We then tested the entire protocol, in true sterile conditions, using tumor cells. We used the human osteosarcoma line MG63. Subsequently, the experiment was continued with human articular chondrocytes that have been subjected to several cycles of perfusion and hydrostatic pressure. Control and pressure-treated chondrocytes were recovered and lysed with specific lysis buffers. The messenger RNA was extracted and the expression of GAPDH,COMP, and of the transcriptional factor SOX9 was evaluated, for each experimental condition. It is evident from the densitometric analysis that the level of the messenger RNA for the transcription factor SOX9, increases in the case of 3D cultures compared to the level of the expanded cells on plastic, doubling in the case of constructs of alginate subjected to pressure stimulation. The result is in agreement with the expected outcomes of the setting and can be regarded as successful control of the stimulation protocol adopted for the operation of the bioreactor.

Questo lavoro di tesi si inserisce nell’ambito della meccanobiologia, e si pone l’obiettivo principale quello di sfruttare e validare un bioreattore applicante alta pressione per lo studio di fattori di trascrizione implicati nella meccanotrasduzione di cellule cartilaginee. Il bioreattore utilizzato, è un apparecchio costruito in acciaio AISI 316L, in grado di applicare regimi di elevata pressione idrostatica (fino a 100 bar) alternati a regimi di sola perfusione dinamica. Dopo aver verificato la funzionalità del sistema, abbiamo eseguito delle prove di validazione biologica su colture cellulari. Abbiamo quindi testato l’intero protocollo di stimolazione meccanica, in condizioni sterili, utilizzando cellule tumorali della linea MG63 da osteosarcoma umano. Successivamente si è proseguito all’esperimento con condrociti articolari umani che sono stati sottoposti a diversi cicli di perfusione e pressione idrostatica. Condrociti di controllo e condrociti sottoposti a stimolo pressorio sono stati recuperati dal BRAD; dalle cellule si è estratto l’mRNA a seguito di lisi con buffers specifici e, per ciascuna condizione sperimentale, si è valutata l’espressione della GAPDH, COMP e del fattore trascrizionale SOX9. Dall’analisi densitometrica è risultato evidente che il livello di RNA messaggero per il fattore trascrizionale SOX9, aumenta nel caso delle colture 3D rispetto al livello delle cellule espanse su plastica, fino a raddoppiare nel caso di costrutti di alginato sottoposti a stimolazione pressoria. Il risultato ottenuto, pertanto, è concorde con quanto atteso e si configura come un controllo positivo degli effetti osservabili mediante il protocollo di stimolazione adottato per il funzionamento del bioreattore.