Synthesis and characterisation of Pluronic hydrogels for biomedical applications

The aim of this thesis work was to develop new hydrogel materials based on Pluronic, an A-B-A block copolymer of poly(ethylene glycol) (PEG) and Poly(propylene glycol) (PPG), to control their final physico-chemical properties and explore their possible applications in nanomedicine. In the last years the use of Pluronic F-127 as biomaterial has been widely investigated, due to its particular physico-chemical characteristics, which include thermoresponsiveness, easy chemical functionalization and relatively good biocompatibility. Previous works have demonstrated the applicability of Pluronic hydrogels in microencapsulation and tissue engineering. Pluronic F-127 was functionalized and then crosslinked both via a Michael-type addition reaction and via radical polymerization (i.e. photopolymerization). In this research project, novel polymeric precursors, namely Pluronic F-127 hexaacrylate (F-127 HA) and Pluronic F-127 thioacetate (F-127 TA), have been successfully sinthesized and easily crosslinked under physiological conditions, to form injectable thermoresponsive gels. These functional Pluronics were characterized using standard chemical analysis (1H-NMR and IR spectra), the crosslinking kinetics was studied using Dynamic Light Scattering and the physical properties of gels, formulated at different polymer concentrations, were also characterised, including swelling and diffusion properties. Pluronic hydrogels obtained from Pluronic diacrylate (F-127 DA) crosslinked through a free radical polymerisation were also tested, in order to assess differences and similarities with Michael-type crosslinked gels. In vitro cell tests were carried out using three different cell lines: fibroblasts, endothelial cells and podocytes, aiming to evaluate their different response in term of cellular adhesion to the gels. In order to promote cell adhesion, Pluronic gels were functionalized with an RGD peptide or pre-treated with serum proteins. It was demonstrated that both gel formulations (i.e Michael-type crosslinked gels and free radical crosslinked gels) can provide good fibroblast adhesion, whereas adhesion was not confirmed for endothelial cells and podocytes, possibly because they may require more complex adhesion mechanisms and cell-matrix signalling. The work was supported by the Fondazione CEN – Centro Europeo di Nanomedicina and it was carried out in Politecnico di Milano laboratories for what concerns Pluronic functionalization and hydrogel formulation, and in Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano – Laboratorio di Nefrologia, for what concerns cytotoxicity and cell adhesion tests. These experiments were carried out to obtain preliminary information on the biological responses of kidney glomerular cells in presence of soft biomaterials, which may find future applications in cell-culture models of kidney pathologies.

Scopo di questo lavoro è lo sviluppo di una libreria di hydrogel a base di Pluronic, un copolimero a blocchi del tipo A-B-A composto da glicole polietilenico (PEG) e polipropilenglicole (PPG), di studiarne le proprietà chimico-fisiche finali e valutare le possibili applicazioni in nanomedicina. Negli anni la ricerca si è ampiamente interrogata sulla possibilità di utilizzare il Pluronic F-127 come biomateriale, considerate le sue caratteristiche fisico-chimiche come la termosensitività, la facile funzionalizzazione e la buona biocompatibilità. Recenti studi hanno dimostrato la possibilità di utilizzare efficacemente il Pluronic F-127 nell’ambito della microencapsulazione e dell’ ingegneria tissutale Nel nostro lavoro il Pluronic F-127 è stato funzionalizzato e quindi reticolato sia tramite addizione di Michael, sia tramite polimerizzazione radicalica (fotopolimerizzazione). La funzionalizzazione ha permesso la sintesi di nuovi precursori polimerici, chiamati Pluronic F-127 esacrilato (F-127 HA) e Pluronic F-127 tioacetato (F-127 TA), in grado di reticolare in condizioni assimilabili a quelle fisiologiche e adatti quindi per applicazioni di tipo biomedicali. Entrambi i nuovi precursori polimerici sono stati caratterizzati tramite spettroscopia NMR e IR, mentre il tempo di gelazione è stato valutato tramite Dynamic Light Scattering. Nel contempo si sono studiate le proprietà fisiche del gel finale, che includono la determinazione dell’indice di swelling e le proprietà di diffusione. Un secondo gel, a base di Pluronic diacrilato (F-127 DA) è stato ottenuto tramite polimerizzazione radicalica e ugualmente caratterizzato con lo scopo di valutare somiglianze e differenze rispetto al gel realizzato tramite addizione di Michael. Infine entrambi i gel sono stati testati in vitro utilizzando tre differenti linee cellulari: fibroblasti, cellule endoteliali e podociti, al fine di valutare la differente risposta biologica e le proprietà adesive. In particolare per favorirne l’adesività, i gel sono stati sia funzionalizzati con un peptide, l’RGD, ampiamente utilizzato in queste applicazioni, sia trattati con medium cellulare. Entrambe le metodologie si sono rivelate efficaci nell’adesione di cellule semplici come i fibroblasti, cosa non confermata nel caso delle più complesse cellule endoteliali e dei podociti. Il presente lavoro è stato supportato finanziariamente dalla Fondazione CEN – Centro Europeo di Nanomedicina ed è stato svolto presso i laboratori del Politecnico di Milano per la parte più propriamente chimica (sintesi e formulazione del gel). I test cellulari in vitro sono stati invece condotti nei laboratori della Fondazione IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano – Laboratorio di Nefrologia. I risultati ottenuti hanno consentito una valutazione preliminare sulla risposta biologica delle cellule costituenti il glomerulo renale alla presenza di biomateriali sintetici, e riguardo la possibilità di produrne un modello 3D utile nello studio delle patologie ad esso associate.