Probing lipid ordering by polarized third harmonic generation microscopy

The present thesis focuses on the experimental study of the ordering of artificial lipid droplets with diseased-related composition by third harmonic generation microscopy. Triacylglycerol-enriched and cholesteryl esters-enriched lipid droplets have been considered in this work because these lipid droplets are the most clinically relevant lipid constituents found in cells and tissues. Such lipid bodies are hallmarks of the most common lipid-related disorders worldwide. Third harmonic generation microscopy has recently been the center of a renovated interest as a probe of the micrometer-scale organization of lipids in biological systems, due to its intrinsic optical sectioning capability and the fact that it does not require sample labeling, along with the achievement of high penetration depths in scattering tissues without an appreciable loss in spatial resolution. Moreover, the combination of this technique with other multiphoton microscopies such as two photon excited fluorescence and coherent anti-Stokes Raman scattering provides a complete framework of structural and functional information about the sample under investigation. In this work, linearly and circularly polarized laser light has been used as excitation source. The results demonstrated that circular polarization provides best image contrast in anisotropic samples. The structural information on artificial lipid droplets drawn by using third harmonic generation microscopy can efficiently contribute to the study of the sub-cellular arrangement of lipids in real biological tissues. In particular, the present work aims at providing new insights on the organization of these biomolecules in tissues affected by lipid-related disorders. The first chapter of the thesis presents an overview of the lipid droplets biology and a description of the principal non-optical and optical techniques for investigating the ordering in samples containing lipid droplets. In the second chapter, third harmonic generation microscopy is considered in more detail. The theoretical background is given and the fundamental works that have been conducted in this field are taken into account, with a particular emphasis on the contrast mechanisms typical of this microscopy technique. The third chapter specifically introduces the materials, i.e. the lipid droplets, and the nonlinear microscope setup used for the experimental measurements. In the fourth chapter a showcase of the experimental THG results of the varied lipid samples and its relevant discussions are presented. The last chapter summarizes the thesis. Future insights and recommendations are also included.

Questo lavoro di tesi si focalizza sullo studio sperimentale dell’ordinamento spaziale di corpi lipidici artificiali aventi una composizione chimica tipica di quelli che caratterizzano tessuti affetti da patologie lipido-correlate. Questo studio è svolto mediate la tecnica di microscopia di generazione di terza armonica. In questo lavoro sono stati considerati corpi lipidici composti da trigliceridi ed esteri del colesterolo perché essi sono i costituenti lipidici più clinicamente rilevanti in cellule e tessuti. Infatti, tali corpi lipidici rappresentano i segni più comuni di patologie lipido-correlate. La microscopia di generazione di terza armonica è stata, recentemente, il centro di un rinnovato interesse in quanto è in grado di indagare l’organizzazione, su scala micrometrica, di lipidi in sistemi biologici. Ciò è dovuto alla sua intrinseca capacità di sezionamento ottico, al fatto che non richiede il “labeling” del campione e all’ottenimento di elevate profondità di penetrazione in tessuti ad alto scattering senza una riduzione significativa della risoluzione spaziale. Inoltre, la combinazione di tale tecnica con altre microscopie multifotoniche come two photon excited fluorescence e coherent anti-Stokes Raman scattering forniscono un panorama completo di informazioni strutturali e funzionali riguardo al campione in oggetto. In questo lavoro, un laser a polarizzazione lineare e circolare è stato utilizzato come sorgente di eccitazione. I risultati mostrano che la polarizzazione circolare è associata al miglior contrasto d’immagine in campioni che esibiscono elevata anisotropia. Le informazioni strutturali su questi corpi lipidici artificiali ottenute attraverso la tecnica sopra menzionata possono efficientemente contribuire allo studio dell’ordinamento sub-cellulare di lipidi in tessuti biologici reali. In particolare, questo lavoro mira a fornire nuove conoscenze sull’organizzazione di queste biomolecole in tessuti affetti da patologie lipido-correlate. Il primo capitolo della tesi fornisce una panoramica della biologia dei corpi lipidici e una descrizione delle principali tecniche ottiche e non ottiche per studiare l’ordinamento spaziale in campioni contenenti corpi lipidici. Nel secondo capitolo, la microscopia di generazione di terza armonica è presa in considerazione con maggior dettaglio. Il background teorico e i lavori fondamentali che sono stati svolti in questo ambito vengono presentati, con un’attenzione particolare ai meccanismi di contrasto tipici di tale microscopia. Il terzo paragrafo introduce specificatamente i materiali, ossia i corpi lipidici, e il setup di microscopia non lineare utilizzato per le misure sperimentali. Il quarto capitolo si concentra sui risultati sperimentali derivanti da misure su diversi campioni lipidici e sule relative discussioni. L’ultimo capitolo riassume la tesi. Sviluppi futuri e indicazioni di lavoro sono inclusi in tale capitolo.