Engineered micro and macroscale human 3D vascularized bone models for the study of organotypic breast cancer metastases

The World Health Organization reports that 14.1 million new cancer cases were diagnosed in 2012 while 8.2 million patients died in the same year. Noteworthy, the spread of primary tumors towards distant organs and the subsequent metastatic colonization is responsible for 90% of cancer-associated mortality. However, despite great advances in basic cancer molecular and cell biology with the discovery of oncogenes and tumor suppressor mechanisms, much remains to be learned about the metastatic process. The cancer biology seed-and-soil paradigm recognizes the existence of organ-specific patterns of metastatization which drive the spread of selected primary tumors towards specific secondary loci. However, despite efforts to model organotypic microenvironments, the organ-specificity of cancer metastases still needs to be elucidated. Then, a deeper understanding of the metastatic cascade and particularly the extravasation process could promote the development of new therapeutics, thus improving cancer survival rates. Particularly, breast cancer is the most frequent cancer among women and the second cause of cancer death in women in more developed regions after lung cancer. Disseminated tumor cells have been reported in the bone of 30%-40% of early stage breast cancer patients while 70% of advanced breast cancer patients are affected by skeletal metastases, leading to pain, due to spinal cord compression and fractures, and often death. So far, in vivo and ex vivo models have been developed to study the extravasation process of cancer cells in mice and zebrafish embryos through intravital microscopy. However, they cannot model all aspects of the interaction and cross-talk between human cancer cells, human endothelial cells and human tissue parenchyma. Moreover, strictly regulated, reproducible parametric studies are difficult to perform. Microfluidics can provide useful model systems to investigate complex phenomena under combination of multiple controllable biochemical and biophysical microenvironments coupled with high resolution real time imaging, thus overcoming limitations of traditional assays, e.g. Boyden chamber, which are characterized by limited imaging capabilities and do not provide tight control over the local environment. Up to now, the application of microfluidic techniques to model cancer metastases and particularly extravasation events has been generally limited to the study of chemotactic events, while no organotypic model has been developed to investigate this key step of the metastatic cascade. However, it is noteworthy to highlight that despite the above mentioned advantages brought by microfluidic approaches, the extremely limited number of cells makes technically hard to perform genetic analyses to investigate the transcription level of key regulatory genes. The present doctoral thesis is focused on the design and optimization of micro and macroscale models to study the organ-specific breast cancer cell metastatization towards the bone. Particularly, a 3D microfluidic model of a bone-mimicking microenvironment surrounded by an engineered microvessel was developed to quantify human breast cancer cell extravasation rate, migration distance and micrometastasis generation within the colonized microenvironment, and to highlight the involvement of the CXCL5/CXCR2 pathway in the organotypic extravasation process. Furthermore, a physiologically-like microfluidic 3D model was designed to investigate human breast cancer cell extravasation into bone- and muscle-mimicking microenvironments through perfusable, functional human microvascular networks composed of endothelial and supportive mural-like cells. This microfluidic model reproduces the pro- and anti-metastatic properties of the microenvironments and provides insights into the different features of organotypic endothelia. The relevance of the present work lies in the application of complex models to investigate and subsequently influence a specific step of the metastatic cascade within different organ-specific microenvironments with critical implications for the development of new drugs, thus fostering a more effective screening of tailored anti-cancer therapies in the context of personalized medicine. Furthermore, a relevant aspect of this doctoral thesis is represented by the design and optimization of human 3D macroscale models of vascularized bone-mimicking tissues through the identification of the optimal combination of experimental parameters leading to the generation of functional vascularized environments, which can be employed to study breast cancer organ-specific metastases by means of post-genomic analyses. Finally, an innovative approach combining microfabrication techniques and self-assembly of vascular structures is discussed in details. Particularly, the main advantages of this approach based on electrochemical cell detachment are the possibility to organize endothelial cells into geometrically defined structures and to produce vessels aligned within micrometric distances in a spatially controlled manner. The unique combination of micro and macroscale 3D models offers a new perspective through which to increase our knowledge of cancer mechanobiology and investigate key molecular pathways involved in organotypic metastases within physiologically-like environments, bridging the gap between traditional in vitro assays and in vivo models.

L'Organizzazione Mondiale della Sanità riporta come 14,1 milioni di nuovi casi di cancro siano stati diagnosticati nel 2012 mentre 8,2 milioni di pazienti siano morti nello stesso anno. In particolare, la diffusione di tumori primari verso organi secondari e la conseguente colonizzazione metastatica è responsabile del 90% della mortalità associata al cancro. Tuttavia, nonostante significativi avanzamenti nella biologia di base del cancro sotto il profilo cellulare e molecolare con la scoperta degli oncogeni e dei meccanismi di inattivazione tumorale, un'ampia ed approfondita conoscenza dei processi metastatici deve ancora essere acquisita. Il paradigma della biologia del cancro noto come teoria "seed and soil" riconosce l'esistenza di specifici percorsi di metastatizzazione organo-specifici che guidano la diffusione di specifici tumori primari verso ben definiti tessuti secondari. Tuttavia, l'organo specificità delle metastasi deve ancora essere approfondita, nonostante diversi tentativi di modellizzare microambienti organo-specifici. Partendo da tali premesse, una più profonda conoscenza della cascata metastatica ed in particolare del processo di extravasazione potrebbe promuovere lo sviluppo di nuove terapie, migliorando in tal modo le statistiche sul tasso di sopravvivenza dei pazienti affetti da cancro. In particolare, il cancro alla mammella rappresenta la causa più frequente di cancro tra le donne e costituisce la seconda causa di morte nelle donne residenti nelle regioni più avanzate del pianeta dopo il cancro al polmone. Cellule metastatiche sono state individuate nelle ossa del 30%-40% dei pazienti affetti da cancro alla mammella nelle fasi iniziali di sviluppo mentre il 70% delle donne colpite da cancro alla mammella in stato avanzato ha riportato metastasi al sistema scheletrico, con conseguente dolore a causa di compressione del midollo spinale e fratture, ed alto rischio di morte. Finora, modelli in vivo ed ex vivo sono stati sviluppati per studiare il processo di extravasazione di cellule tumorali in topo oppure embrioni di pesce zebra attraverso tecniche di "intravital microscopy". Tuttavia, tali modelli non consentono di analizzare tutti gli aspetti delle interazioni tra cellule di cancro alla mammella, cellule endoteliali e tessuti secondari di origine umana. In aggiunta, studi parametrici altamente controllati e riproducibili risultano complessi da effettuare. La microfluidica può fornire utili modelli per analizzare tali complessi fenomeni attraverso la combinazione di microambienti chimico-fisici controllabili e tecniche di imaging in alta risoluzione in tempo reale, superando in tal modo le limitazioni di saggi tradizionali, tra cui la Boyden chamber, caratterizzati da limitate possibilità di imaging e ridotto controllo dell'ambiente locale. Finora, l'applicazione di tecniche microfluidiche per modellizzare i processi metastatici ed in particolare eventi di extravasazione è stata limitata allo studio dei processi chemotattici mentre nessun modello organotipico è stato sviluppato per analizzare questo specifico passaggio della cascata metastatica. Tuttavia, è significativo osservare come nonostante i vantaggi intrinseci nell'utilizzo di tecniche microfluidiche, il limitato numero di cellule introdotte renda complessa l'effettuazione di analisi genetiche per studiare il livello di trascrizione di geni regolatori chiave. La presente tesi di dottorato è focalizzata sulla progettazione ed ottimizzazione di modelli alla micro e macroscala per lo studio della metastatizzazione organo-specifica del cancro alla mammella verso il tessuto osseo. In particolare, la tesi discute lo sviluppo di un modello microfluidico tridimensionale rappresentante il microambiente osseo circondato da un microvaso ingegnerizzato per la quantificazione del tasso di extravasazione di cellule di carcinoma mammario umano, della distanza di migrazione e della generazione di micrometastasi al'interno del microambiente colonizzato, e per l'analisi dell'importanza del pathway CXCL5/CXCR2 nel processo organo-specifico di extravasazione. Inoltre, un modello microfluidico tridimensionale fisiologico è stato progettato per analizzare l'extravasazione di cellule di carcinoma mammario verso microambienti caratteristici del tessuto osseo e del tessuto muscolare scheletrico attraverso reti microvascolari funzionali e perfondibili composte da cellule endoteliali e cellule murali di origine umana. Tale modello microfluidico riproduce le proprietà pro ed antimetastatiche di ogni specifico microambiente e fornisce nuovi dati sulle diverse proprietà di tessuti endoteliali organo-specifici. La rilevanza del presente lavoro di tesi risiede nell'applicazione di complessi modelli per analizzare ed influenzare uno specifico aspetto della cascata metastatica all'interno di differenti microambienti organo-specifici, con significative implicazioni per lo sviluppo di nuovi farmaci, promuovendo in tal modo uno screening più efficace di terapie anticancro specifiche nel contesto della medicina personalizzata. In aggiunta, un aspetto rilevante del presente lavoro di tesi è costituito dalla progettazione ed ottimizzazione di modelli tridimensionali umani di tessuto osseo vascolarizzato attraverso l'identificazione della combinazione ottimale di parametri sperimentali in grado di generare ambienti vascolarizzati funzionali che possano essere impiegati per lo studio delle metastasi organo-specifiche del cancro della mammella mediante analisi post genomiche. Infine, un approccio innovativo in grado di combinare tecniche di microfabbricazione e self assembly di strutture vascolari è ampiamente discusso. In particolare, i vantaggi principali di tale approccio basato sul distacco cellulare elettrochimico sono rappresentati dalla possibilità di organizzare cellule endoteliali in strutture geometricamente definite e di produrre vasi allineati con precisione micrometrica in modo controllato. La combinazione unica di modelli tridimensionali alla micro e macroscala offre una nuova prospettiva attraverso cui incrementare la conoscenza della meccanobiologia del cancro ed analizzare pathway molecolari chiave coinvolti nell'organo specificità delle metastasi all'interno di ambienti fisiologici, colmando la distanza tra saggi in vitro tradizionali e modelli in vivo.