Autore REGALIA, GIULIA
Relatore FERRIGNO, GIANCARLO
Coordinatore ALIVERTI, ANDREA
Tutor SIGNORINI, MARIA GABRIELLA
Correlatore/i PEDROCCHI, ALESSANDRA LAURA GIULIA
Data 20-mar-2015
Titolo della tesi IN VITRO ELECTROPHYSIOLOGICAL STUDIES OF NEURONAL NETWORKS: A NOVEL DEVICE FOR RELIABLE, PROLONGED AND HIGH THROUGHPUT MICROELECTRODE ARRAY EXPERIMENTS
Titolo in inglese In vitro electrophysiological studies of neuronal networks: a novel device for reliable, prolonged and high throughput Microelectrode Array experiments
Abstract in italiano Lo scopo del presente lavoro di Dottorato è di avanzare i dispositivi tecnologici impiegati per indagini elettrofisiologiche in vitro di reti neuronali tramite matrici di microelettrodi (MEA). Le colture primarie di cellule neuronali accoppiate ai substrati MEA rappresentano oggi una metodologia essenziale per studiare le proprietà elettrofisiologiche di reti neuronali in condizioni fisiologiche e patologiche. Registrazioni non invasive e multi-sito dell'attività elettrica neuronale tramite MEA sono sfruttate in molti studi riguardanti dinamiche neuronali di rete, plasticità neuronale e test farmacologici e tossicologici. Dato il ruolo atteso dei risultati da questi studi nell'ambito della ricerca in Neuroscienza, è fondamentale che gli esperimenti MEA producano risultati affidabili e riproducibili. A questo fine, un requisito cruciale è la presenza di condizioni ambientali fisiologiche durante l'acquisizione dell'attività neuronale. Tuttavia, la rimozione ripetuta delle colture dall'incubatore per effettuare gli esperimenti MEA provoca una deviazione dei parametri ambientali (in termini di temperatura e composizione gassosa) dalle condizioni canoniche di coltura, nonchè stress meccanico alle cellule e aumento del rischio di infezione. Affinchè queste perturbazioni non inducano alterazioni funzionali e non diminuiscano la vitalità cellulare, la durata delle singole sessioni sperimentali è limitata a circa un'ora. Ciò impedisce di tracciare senza interruzione processi neuronali che si sviluppano nell'arco di un periodo esteso (ad esempio, diverse ore o giorni), come la maturazione, la plasticità a lungo termine o effetti di trattamenti farmacologici cronici. Nonostante tentativi di miglioramento dei setup sperimentali MEA standard, ad oggi non esistono, né in commercio né a livello prototipale, soluzioni sperimentali per risolvere adeguatamente il problema suddetto. Per rispondere a questa esigenza, lo scopo di questo progetto di Dottorato è la realizzazione di una camera ambientale autonoma che assicuri condizioni fisiologiche stabili durante registrazioni MEA e migliori l'affidabilità dei dati e la comparabilità tra replicati sperimentali. La tesi descrive in dettaglio il progetto e la verifica del sistema, comprendendo verifiche di performance e la validazione biologica del dispositivo, costituito da: (a) una camera da banco per alloggiare colture neuronali su MEA; (b) sistemi per la riproduzione ed il monitoraggio di un ambiente fisiologico nella camera, senza richiedere l'intervento dell'operatore; (c) un'interfaccia elettronica per la lettura dei segnali MEA; (d) un software per analisi on-line dei segnali MEA, per ridurre il tempo richiesto per le analisi di dati ottenuti nel corso di esperimenti prolungati. E' stato possibile ottenere condizioni ambientali stabili ed uniformi nella camera, garantendo una vitalità cellulare paragonabile a quella di incubatori da laboratorio. L'attività di colture cresciute nel dispositivo non ha presentato deviazioni funzionali, garantendo un monitoraggio dello stato intrinseco dei diverse colture in parallelo nel lungo termine (da poche ore a diversi giorni). Inoltre, il dispositivo ha permesso di ottenere dati riproducibili da esperimenti farmacologici dose-risposta. La piattaforma realizzata rappresenta dunque una soluzione efficiente per indagare fenomeni neuronali caratterizzati da dinamiche lente, come plasticità a lungo termine e meccanismi alla base di patologie neurodegenerative con tardo onset, quale ad esempio l'Alzheimer.
Abstract in inglese The aim of this PhD project is to progress technological devices used to perform in vitro electrophysiological investigations of neuronal networks by means of substrate-integrated microelectrodes (i.e., Microelectrode Arrays, MEAs). Cultures of primary central neuronal cells coupled to MEA represent an unparalleled methodology to study network-level electrophysiological properties of neuronal ensembles in both physiological and pathological conditions. Nowadays, non-invasive and multisite MEA recordings of neuronal electrical activity are deployed in many studies about neuronal networks dynamics, neuronal plasticity and drug and toxicology tests. Due to the role that results from these studies are expected to play in Neuroscience research, reliability and reproducibility of the experimental outcome are essential for MEA-based studies. To this aim, a crucial requirement is the presence of physiological conditions during neuronal activity acquisition. However, the recurrent withdrawal of cultures from the cell incubator to perform MEA recordings results in the deflection of environmental parameters (e.g. temperature and gaseous atmosphere composition) from canonical in vitro growth conditions, in mechanical stress to the cultures and in increased infection risk. In order not to trigger functional alteration and changed cell viability, the duration of single experimental sessions is limited (i.e. up to 1 hour). This prevents from performing the uninterrupted tracing of neuronal processes that develop over extended periods of time (e.g. several hours to several days or weeks), such as network development, long-term plasticity or effects of chronic pharmacological treatments. Notwithstanding previous efforts to improve standard MEA experimental setups, to date no definite experimental platform has been proposed to fully face this issue, neither with commercial MEA experimental platforms nor with custom setups. To fill this gap, the aim of this PhD project is to realize a stand-alone and portable environmental chamber which assures stable and incubator-like conditions during MEA recordings and enhance data reliability and comparability between experimental replicates. The thesis describes the design and the validation of the whole system, including performance verification and biological validation of the prototype. The devised platform has been built on the integration of: (a) a compact chamber housing multiple neuronal cultures coupled to MEA chips, to permit parallel experiments; (b) systems to reproduce and monitor the appropriate environment in the chamber (in terms of temperature, air relative humidity and carbon dioxide concentration), avoiding operator intervention; (c) an electronic front-end to record signals from multiple MEAs; (d) a software for on-line MEA signal processing, to reduce time required to analysis of long lasting data. Once these elements have been developed and integrated, the main attained results are: (1) environmental conditions stable and homogeneous in the chamber, assuring cell viability comparable to cell incubators, (2) reliable and parallel MEA data over prolonged recordings of spontaneous activity, without observing cell culture decline or artifactual activity, (3) reproducible data from pharmacological dose-response experiments and (4) a versatile software for off-line and on-line spike classification. To conclude, the developed experimental platform represents an effective solution to dissect long-lasting neuronal network phenomena such as long-term plasticity, neuro-active compound dose-dependent activity, chronic effects of pharmacological treatments and mechanisms at the basis of late-onset neurodegenerative pathologies mimicked in vitro (e.g. Alzheimer's disease).
Tipo di documento Tesi di dottorato
Appare nelle tipologie: Tesi di Dottorato
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: http://hdl.handle.net/10589/108856