Progettazione di un sistema compatto ad elevato range dinamico per applicazioni di rilevazioni di fluorescenza

Since the discovery of DNA and its decoding through the revolutionary PCR technique, the biolomolecular research sector obtained a great success thanks to the benefits that this kind of information brought, from forensic, to medical and agroindustrial fields. Different techniques consequently developed from PCR, in order to obtain more information from the same sample. For example, Real time PCR gives also quantitative information despite of pure qualitative analysis of PCR. In 2003 HGP project turned out with the classification of the complete human genome. It created, therefore, a complete classification of human genes and allowed the identification of which of those bring mutations and diseases. The most used instrument to make these kind of analysis is the termociclator. It is a bulky instrument and it only analyzes an already prepared sample, so the presence of specialized operators and equipment is necessary. Avoiding the demand of specialized laboratory and operators could bring to the development of point-of-care diagnostic tests. The new aspiration is to develop an instrument with high portability, user-friendly, cheap and with the same specificity of a laboratory instrument. A great number of companies began to invest in this kind of devices. STMicroelectronics has developed a Real-time PCR system based on Lab-On-Chip: the Q3Plus. The Q3 Plus is able to recognize up to four different targets in a single test. It is structured in three sub-systems: a disposable chip where the reaction takes place, a thermal control system (TCS) that manages the execution of the experiment and at a precise moment of the operation, it sends a signal to the optical control system (OCS) which leads the detection. Beside the presence of a CMOS sensor to acquire the image, the OCS is composed of four LED system, each one provided with particular optical filter. LEDs through an excitation filter light the sample and the CMOS sensor reads the filtered signal from an emission filter arranged in the front of it. After the acquisition of the image, the data are ready to be sent to a PC which retrieves the information from the complete data analysis. This thesis is focused on the investigation of the optical system in order to improve the quality of data and to increase the number of observable targets in the same test. Starting from the selection and description of a new sensor capable of going beyond these limitations, this work concludes with the test of the selected sensor. The present work is organized in the following chapters: • Chapter 1: description of the fundamental techniques of DNA detection, underlining benefits, disadvantages and foremost application and instruments; • Chapter 2: introduction to the system under examination, in order to analyze its limitation and justify the choices made through the work; • Chapter 3: delineation of the chosen sensor and description of the components needed and the methodology used for evaluation; • Chapter 4: details of hardware implementation and firmware description to manage peripherals; • Chapter 5: conclusions and overview of improvements.

La scoperta del DNA e il successivo sviluppo di tecniche per sfruttare le informazioni che immagazzina, rappresentano le grandi rivoluzioni dello scorso secolo nel campo della biologia molecolare. Nel 1983 Kary Mullis sviluppa la PCR, una tecnica attualmente indispensabile, usata per diverse applicazioni dalla medicina alla diagnostica forense e nel campo agroalimentare. L’interesse che ha suscitato la PCR ha portato a sviluppare diverse tecniche volte ad ottimizzare le informazioni ottenibili dall’analisi. Ad esempio la Real-Time PCR, grazie ad un’analisi di fluorescenza, fornisce risultati quantitativi, rispetto alla classica PCR intrinsecamente qualitativa. Ciò ha permesso di raggiungere obbiettivi importanti, ad esempio nel 2003 è stata completata la mappatura completa del genoma umano ad opera del HGP (Human Genome Project) un progetto di ricerca scientifica internazionale. Esso ha permesso l’identificazione dei geni responsabili di determinate malattie o mutazioni. Per poter effettuare analisi comparative oltre ad essere in possesso di una sequenza d’interesse di DNA, è necessario uno strumento che permetta di analizzare i campioni. Allo stato attuale lo strumento più utilizzato è il termociclatore, che oltre ad essere ingombrante, necessita di un laboratorio attrezzato per la preparazione del campione. Poter effettuare queste analisi con versatilità nel luogo dove è necessario, garantendo comunque le prestazioni di uno strumento di laboratorio è un prerequisito dello spostamento verso test diagnostici al point of care. Ciò ha portato lo sviluppo di tecnologie in grado di analizzare campioni di DNA con strumenti che possano rispondere alle principali esigenze di utilizzo (alta specificità, poco ingombro, consumo energetico contenuto, costo dei reagenti limitato). Date queste esigenze, molte aziende hanno iniziato a investire nel campo della miniaturizzazione di strumenti in grado di effettuare analisi specifiche senza l’ausilio di laboratorio e personale specializzato. L’azienda di semiconduttori STMicroelectronics ha progettato e sviluppato un innovativo sistema di Real-time PCR basato su Lab-On-Chip. Il sistema oggetto di analisi in questo lavoro di tesi è lo strumento Q3 Plus. Attualmente il dispositivo è in grado di monitorare fino a quattro target nello stesso test. Il sistema è composto da tre elementi fondamentali: una parte di controllo termico, una di eccitazione e rivelazione ottica e il chip disposable in cui è presente il campione e dove avviene la reazione. Le fasi della reazione sono controllate dalla scheda di controllo termico (TCS), che al momento opportuno invia un segnale alla scheda di controllo ottico (OCS), per effettuare un’analisi di fluorescenza del campione. Un sistema di LED e filtri ottici eccita il campione e un sensore CMOS rileva il segnale di risposta all’eccitazione. In base all’analisi dei dati è possibile ricavare informazioni riguardo il campione analizzato. Il presente lavoro di tesi si incentra sull’analisi delle limitazioni del sistema di rilevazione dell’attuale sistema. Ciò è seguito dalla ricerca e verifica di un sensore ottico che possa superare tali limiti. La tesi si sviluppa nelle seguenti sezioni: • Capitolo 1: descrizione delle principali tecniche di amplificazione e rivelazione del DNA, evidenziando vantaggi, svantaggi e principali applicazioni e strumenti utilizzati; • Capitolo 2: analisi delle caratteristiche del dispositivo in esame. Di esso vengono analizzate le parti che lo compongono, il cui studio è necessario per giustificare le scelte di progetto compiute; • Capitolo 3: scelta del sensore e descrizione dei componenti necessari alla valutazione; descrizione dello svolgimento del lavoro a seguito una fase di progettazione di una nuova scheda di test per verificare l’interfacciamento e di una scheda di integrazione per dialogare con PC e TCS; • Capitolo 4: dettagli dell’implementazione hardware e realizzazione firmware del microcontrollore per la gestione del hardware; • Capitolo 5: conclusioni con le necessarie considerazioni per un possibile sviluppo futuro per il miglioramento del sistema.